紫杉醇提取方法和曼地亚红豆杉HPLC指纹图谱的研究

李乃伟+束晓春+彭峰

摘要：为考察不同提取方法和HPLC检测方法对紫杉醇HPLC检测图谱的影响，采用4种不同提取方法对曼地亚红豆杉枝叶中的紫杉醇进行粗提，并通过3种不同的HPLC检测方法对粗提物进行了检测。通过HPLC检测图谱的比较，确立了曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇的粗提方法和HPLC检测方法。色谱条件：色谱柱为Curosil-PFP分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;检测波长为227 nm;流动相为乙腈-水溶液梯度洗脱;流速2.6 mL/min;分析时间70 min;柱温为30 ℃。

关键词：紫杉醇;提取方法;HPLC检测;曼地亚红豆杉

中图分类号： R284.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0296-03

收稿日期：2014-05-11

基金项目：江苏省农业科技自主创新基金[编号：CX（12）2014]。

作者简介：李乃伟（1983—），男，山东聊城人，硕士，助理研究员，主要从事生物技术研究。E-mail：linaiwei8828@163.com。

紫杉醇是红豆杉属（Taxus）植物特有的药物成分，在植物体中含量很低，并与多种类似物共存，而且提取时常带有很多色素、树胶等杂质。得率高、重复性好的提取方法和高效液相色谱（HPLC）检测方法，是进行紫杉醇含量调控研究的首要条件。目前，已有很多关于紫杉醇提取纯化的报道[1-4]，然而，这些方法适用于检测纯度较高的紫杉醇成品和半成品，在产业化生产中应用时存在一定缺陷。国内紫杉醇提取往往采用粗提方法，而不采用成本太高的工艺程序。笔者比较了不同提取方法和不同色谱条件对紫杉醇粗提液HPLC检测的影响，以期筛选一种简便提取、精确检测紫杉醇的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为江苏省中科院植物所（南京中山植物园）实验苗圃内引种栽培的曼地亚红豆杉。11月取样，采取当年生枝条，置于40 ℃烘箱7 d。烘干后粉碎，置于干燥器中密闭保存。

1.2 药品与试剂

紫杉醇提取所用试剂均为分析纯，HPLC检测所用紫杉醇对照品购自安徽尔塔医药科技有限公司。标准品用甲醇溶解，配成浓度为0.12 mg/mL的溶液。

1.3 提取方法

采用4种不同方法提取样品材料中的紫杉醇。 （1）精确称取样品5 g，甲醇回流（70 ℃）提取3次：第1次，100 mL甲醇，2 h;第2次，50 mL甲醇，1 h;第3次，50 mL甲醇，1 h。将浸提掖浓缩至100 mL后，加等体积正己烷，萃取4次，每次100 mL，然后，取甲醇相浓缩定容至25 mL。 （2）提取过程同方法（1），在正己烷萃取除杂后进行C18过柱处理，进一步除杂。 （3）提取过程同方法（1），用水代替甲醇浸提，回流温度为100 ℃，用三氯甲烷代替正己烷进行萃取。 （4）提取过程同方法（3），在三氯甲烷萃取除杂后进行C18过柱处理，进一步除杂。

1.4 紫杉醇HPLC检测条件

采用以下3种方法对紫杉醇粗提液进行HPLC检测的比较。 （1）参照王文芝的HPLC方法[5]改进。采用Agilent-1100高效液相色谱仪，DAD监测器，检测波长为228 nm。选用Kromasil ODS-C18分析柱（250×4.6 mm，5 μm），柱温 30 ℃，流速0.8 mL/min，流动相梯度条件：乙腈 ∶ 水（0.4%磷酸液，pH值3.5）为48 ∶ 52。 （2）完全参照美国药典中的HPLC方法[6]。采用Agilent-1100高效液相色谱仪，DAD监测器，检测波长为227 nm。选用五氟苯基Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，流速 2.6 mL/min。流动相梯度条件，梯度洗脱：0～35 min保持乙腈-水（体积比35 ∶ 65）;35～60 min乙腈从35%升至80%，水从65%降至20%;60～70 min乙腈从80%降回35%，水从20%升回65%;70～80 min，保持乙腈-水（体积比35 ∶ 65）。 （3）参照美国药典的HPLC方法进行改进，采用Agilent-1100高效液相色谱仪，DAD监测器，检测波长为227 nm。选用Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm）;柱温30 ℃;流速2.6 mL/min。流动相梯度条件：0～35 min保持乙腈-水（体积比30 ∶ 70）;35～60 min乙腈从30%升至50%，水从70%降至50%;60～61 min乙腈从50%降回30%，水从50%升回70%;61～70 min，保持乙腈-水（体积比30 ∶ 70）。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对紫杉醇HPLC检测的影响

采用王文芝的HPLC改进方法，对不同方法提取的紫杉醇粗提液进行检测。图1至图4为不同方法的紫杉醇粗提样品HPLC图谱。从各图谱中紫杉醇峰面积的大小可以看出，通过甲醇/正己烷萃取的紫杉醇得率（图2、图3）明显高于氯仿/水（图4、图5）提取得率。过柱除杂（图3、图5）与未过柱（图2、图4）的紫杉醇提取方法，对HPLC检测结果影响并不显著。

2.2 不同检测方法对紫杉醇HPLC检测的影响

对通过正己烷/水萃取的未过柱紫杉醇粗提样品，进行3

种不同条件的HPLC检测。图6至图11显示了不同检测方法对样品分离与峰形的影响。3种方法中，参照王文芝的HPLC方法进行改进的HPLC检测图谱（图7），各样品分离效果最差。参考美国药典的HPLC检测图谱（图8、图9），各样品分离度高，但进样速度过大，柱压太高对分析柱损伤很大。改进后的美国药典HPLC检测方法，流速降低，柱压减小，检测图谱（图10、图11）显示，虽然出峰时间延迟，但峰形及分endprint

离度未受影响。采用C18分析柱检测的紫杉醇峰面积大于采用五氟苯基Curosil-PFP分析柱检测的峰面积（即美国药典HPLC方法及其改进方法），但是前者图谱（图7）的紫杉醇临近峰数量少于后者（图11）。推测原因是，采用C18分析柱检测的方法分离度低，检测出的紫杉醇峰可能为重叠峰，该色谱条件下无法分开一些与紫杉醇结构相似的化合物。而五氟苯基分析柱及梯度洗脱，可以将化合物结构相近的重叠峰分开。

3 结论

通过对不同提取方法与检测方法的比较，筛选出曼地亚红豆杉枝叶粗提紫杉醇的方法为：甲醇回流（70 ℃）提取3次：第1次，100 mL甲醇，2 h;第2次，50 mL甲醇，1 h;第3次，50 mL甲醇，1 h。将浸提液浓缩至100 mL后，加等体积正己烷，萃取4次，每次100 mL，然后，取甲醇相浓缩定容至 25 mL。色谱条件为：采用Agilent-1100高效液相色谱仪，DAD监测器。选用五氟苯基Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm）;柱温30 ℃;流速2.6 mL/min;检测波长为227 nm。0～35 min保持乙腈-水（体积比30 ∶ 70）;35～ 60 min 乙腈从30%升至50%，水从70%降至50%;60～ 61 min 乙腈从50%降回30%，水从50%升回70%;61～ 70 min，保持乙腈-水（体积比30 ∶ 70）。该提取方法和检测条件可以用在栽培红豆杉紫杉醇的含量调控研究中。

参考文献：

[1]阎家麒，范金城，王九一. 紫杉醇提取纯化工艺[J]. 中国医药工业杂志，1996，27（12）：531-534.

[2]张志强，田桂莲，冯小黎，等. 从红豆杉树皮浸膏中提取紫杉醇初分离工艺的研究[J]. 中国生化药物杂志，1999，20（2）：58-61.

[3]李春斌，佟憬憬，范圣第. 东北红豆杉紫杉醇的提取纯化与HPLC检测[J]. 大连民族学院学报，2005，7（5）：22-25.

[4]乔亮杰，满瑞林，倪网东，等. 曼地亚红豆杉枝条中紫杉醇的提取纯化研究[J]. 中国中药杂志，2009，34（8）：973-976.

[5]王文芝. 西藏红豆杉中紫杉醇及相关紫杉烷含量的高效液相色谱分析[J]. 色谱，1997，15（3）：76-78.

[6]The United States Pharmacopeial Convention Inc. United States pharmacopeia/national formulary：USP28-NF23[M]. Philadelphia，USA：National Publishing，2005：1456-1457.endprint