中药复方多糖对鸡红细胞免疫功能和SOD活性的影响

商云霞+朱晓庆+谷新利+李效振+乔海博+贾书红+张东升

摘要：将300羽雄性良凤青脚麻鸡随机分为6组，即对照组、盐酸左旋咪唑组、黄芪多糖组、高、中、低剂量一定纯度中药复方多糖组，每组50羽。分别于8日龄皮下注射生理盐水及盐酸左旋咪唑、黄芪多糖和不同剂量的一定纯度中药复方多糖，连续7 d，在免疫后8、14、21、35、42 d采血，测定外周血中红细胞C3b受体花环率、红细胞免疫复合物花环率、SOD含量。试验结果表明，黄芪多糖和一定纯度中药复方多糖均能显著升高红细胞-C3b花环率和红细胞-IC花环率，增强SOD活性，最佳纯度中药复方多糖组免疫效果优于黄芪多糖，以中剂量中药复方多糖效果最好。

关键词：鸡;中药复方多糖;黄芪多糖;盐酸左旋咪唑;红细胞免疫功能;超氧化物歧化酶

中图分类号： S858.312.4 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0214-03

收稿日期：2014-12-17

基金项目：国家自然科学基金（编号：30960291）。

作者简介：商云霞（1965—），女，新疆奎屯人，高级实验师，研究方向为动物疫病防治。E-mail：shangyunxia@shzu.edu.cn。

中医药与免疫学的关系极为密切。我国古代就已认识到疾病的发生和机体的抵抗力（免疫力）密切相关，在世界上最早应用免疫学的方法防治疾病。免疫学对中医药的发展具有极其重要的推动作用，在阐明中医药防病、治病机理，研究中药有效成分，提高中药临床疗效等方面都具有十分重要的意义。随着现代免疫学和分子生物学的发展，人们发现许多中草药中的多糖成分能通过促进淋巴细胞增殖、转化和抗体生成，增加红细胞数量，升高红细胞-C3b花环率、红细胞-IC花环率及红细胞补体受体1（CR1）数量和活性等方式来提高机体免疫力，改善机体免疫状态。并且红细胞上的多种免疫相关的物质，如超氧化物歧化酶（SOD）、CR1、CR3[1]等分工合作，使红细胞具有识别、黏附、浓缩抗体和清除免疫复合物、增加LAK细胞数量、激活NK细胞，参与机体免疫调控作用[2]。与此同时，从中草药提取的粗提物中含有大量杂质，影响在应用时的稳定性[3]。本研究通过比较已证实能增强小鼠免疫力的经AB-8大孔吸附树脂吸附解吸附后得到的对小鼠免疫增强效果最好的一定纯度中药复方多糖（cCHMPS）、单味中药多糖黄芪多糖（APS）、人工合成免疫增强剂盐酸左旋咪唑（LM）对鸡红细胞C3b受体花环率、红细胞免疫复合物花环率和SOD活性的动态变化，为筛选出一定纯度中药复方多糖的最适免疫增强剂量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物

中药复方由党参、山植、熟地、川芎、何首乌、当归等11味中药组成，各单味药均购自新疆石河子市医药公司;中药复方多糖粗提物是从中药复方中采用水提-醇沉法提取。纯化后中药复方多糖是中药复方多糖粗提物经AB-8大孔吸附树脂吸附解吸附后获得。多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，纯化后中药复方多糖的含糖量为77.10%。用灭菌蒸馏水将纯化后中药复方多糖配制成高、中、低（50、25、12.5 mg/mL）3个剂量浓度，经0.22 μm微孔滤膜滤过后4 ℃储存备用;黄芪多糖由石河子大学化工学院采用水提-醇沉法提取，含糖量为29.42%，用灭菌蒸馏水配制成25 mg/mL的剂量浓度，经0.22 μm微孔滤膜滤过后4 ℃储存备用;盐酸左旋咪唑注射剂购自上海申亚动物保健品有限公司;鸡新城疫疫苗（La Sota株和CS2株）购自新疆石河子市八师兽医站;冻干补体致敏酵母多糖和未致敏酵母多糖由第二军医大学长海医院免疫室提供;鸡超氧化物歧化酶试剂盒（ELISA）购自上海蓝基生物科技有限公司。

1.2 动物及分组

一定纯度中药复方多糖组（1）高剂量（cCHMPSH 50 mg/mL）;（2）中剂量（cCHMPSM 25 mg/mL）;（3）低剂量（cCHMPSL 12.5 mg/mL）;（4）黄芪多糖组（25 mg/mL APS）;（5）盐酸左旋咪唑组50 mg/mL LM唑;（6）生理盐水组（对照）。1日龄雄性良凤青脚麻鸡由新疆石河子市某养鸡场提供，临床检查健康。将试验鸡于7日龄时随机分为6组，每组50羽。于8日龄分别皮下注射，0.2 mL/羽，连续注射7 d。

所有试验鸡于7日龄时用鸡新城疫活疫苗（La Sota株）滴鼻、点眼免疫，27日龄用鸡新城疫疫苗（CS2株）进行二免。

1.3 饲养管理

饲料购自新疆天康饲料厂，0～4周龄，饲料中粗蛋白质≥20.0%、粗纤维≤4.5%、钙0.80%～1.30%、总磷≥060%、食盐0.30%～0.80%;5～8周龄，饲料中粗蛋白质≥19.0%、粗纤维≤5.5%、钙0.70%～1.20%、总磷≥0.60%、食盐030%～0.80%。

6组鸡采用相同的饲养方法、饲养条件、环境、饲料品质及饲养管理进行常规饲养。

1.4 试验方法

1.4.1 红细胞C3b受体花环率测定 每组随机抽取5羽试验鸡，于免疫后8、14、21、28、35、42 d翅静脉采血0.1 mL，按照文献[4-6]方法进行致敏酵母多糖和红细胞悬液的制备，红细胞C3b受体花环数的计数和红细胞C3b受体花环百分率的计算。

1.4.2 红细胞IC花环率测定 把“1.4.1”节中的致敏酵母多糖改为酵母多糖，其他操作相同，计算出红细胞IC花环百分率。

1.4.3 超氧化物歧化酶（SOD）含量测定 每组随机抽取5羽试验鸡，于免疫后8 d心脏采血，14、21、28、35、42 d翅静脉采血，常规分离血清。用SOD ELISA检测试剂盒在酶标仪450 nm处检测D值，并绘制标准曲线，根据标准曲线计算鸡SOD的浓度。

1.5 数据分析endprint

各项免疫指标数据结果以“平均数±标准差”（x±s）表示，用SPSS 13.0进行单因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 红细胞C3b花环率的动态变化

不同日龄雏鸡红细胞C3b受体（RBC-C3b）花环率测定结果见表1。由表1可知，不同处理均能不同程度地提高鸡RBC-C3b花环率。并且首免后8 d，cCHMPSM组、cCHMPSH组RBC-C3b显著高于对照组和LM组;首免后14 d，cCHMPSM组极显著高于对照组，显著高于LM组;首免后 21 d，cCHMPSM组极显著高于对照组和LM组，显著高于APS组，cCHMPSH组、cCHMPSL组显著高于对照组和LM组;首免后28 d，cCHMPSL组显著高于对照组，cCHMPSM组极显著高于对照组，显著高于LM组;首免后35 d，cCHMPSM组极显著高于对照组和LM组，显著高于APS组，cCHMPSH组显著高于对照组和LM组;免疫后42 d，APS组极显著高于对照组，显著高于LM组，各剂量cCHMPS组均极显著高于对照组和LM组。

表1 不同处理红细胞C3b花环率的动态变化

处理

首免后不同时间红细胞C3b花环率（%）

8 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d

cCHMPSH 6.63±0.28bA 7.20±0.72abAB 8.03±0.42bcAB 7.90±0.53abcABC 7.80±0.26bcAB 7.43±0.09cC

cCHMPSM 6.70±0.25bA 8.07±0.23bB 8.93±0.32cB 8.63±0.43cBC 8.73±0.66cB 7.77±0.44cC

cCHMPSL 6.23±0.20abA 7.10±0.53abAB 7.90±0.32bcAB 8.17±0.50bcABC 7.60±0.29abcAB 7.33±0.54cC

APS 6.17±0.50abA 7.30±0.53abAB 7.70±0.52abAB 7.90±0.12abcABC 7.37±0.09abAB 7.00±0.06bcBC

LM 5.60±0.32aA 6.30±0.25aB 6.77±0.19aA 7.30±0.47abAB 6.23±0.64aA 5.63±0.12abAB

对照 5.47±0.23aA 6.07±0.22aA 6.67±0.34aA 6.73±0.33aA 6.30±0.46aA 5.40±0.47aA

注：同列数据后小写、大写字母不同者分别表示差异显著（P<0.05）、极显著（P<0.01）。表2、表3同。

2.2 红细胞IC花环率的动态变化

不同日龄雏鸡红细胞免疫复合物（RBC-IC）花环率测定结果见表2。由表2可知，不同处理均能不同程度地提高鸡RBC-IC花环率。首免后8 d，cCHMPSM组RBC-IC花环率显著高于对照组和LM组;首免后14 d，cCHMPSM组极显著高于对照组、LM组和APS组，显著高于cCHMPSL组;首免后21 d，cCHMPSM组极显著高于对照组和LM组，显著高于APS组，cCHMPSH组和cCHMPSL组极显著高于对照组和LM组;首免后28 d，APS组显著高于对照组，cCHMPSL组显著高于对照组和LM组，cCHMPSM组极显著高于对照组和LM组，显著高于cCHMPSL组和APS组，cCHMPSH组极显著高于对照组和LM组;首免后35 d，cCHMPSM组极显著高于对照组和LM组，cCHMPSH组显著高于对照组;首免后42 d，APS组显著高于对照组，cCHMPSL组显著高于对照组和LM组，cCHMPSM组极显著高于对照组和LM组，cCHMPSH组显著高于对照组。

表2 不同处理红细胞IC花环率的动态变化

处理

首免后不同时间红细胞IC花环率（%）

8 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d

cCHMPSH 8.63±0.35abA 9.53±0.28abcAB 10.63±0.46bcB 10.80±0.32abcABC 9.67±0.43bcAB 8.83±0.38bcAB

cCHMPSM 8.93±0.23bA 10.70±0.46cB 11.10±0.36cB 11.73±0.61cC 10.43±0.33cC 9.87±0.17cC

cCHMPSL 8.47±0.28abA 9.27±0.33abAB 10.33±0.30bcB 10.17±0.23cAB 9.40±0.67abcABC 9.10±0.12ccAB

APS 8.10±0.36abA 8.83±0.52aA 9.67±0.43abAB 9.97±0.47abcABC 9.27±0.19abcABC 8.93±0.35bcAB

LM 7.93±0.33aA 8.53±0.34aA 8.80±0.31aA 8.93±0.43abAB 8.40±0.72abAB 8.03±0.48abAB

对照 7.77±0.23aA 8.37±0.44aA 8.63±0.24aA 8.67±0.15aA 8.17±0.32aA 7.67±0.39aA

2.3 SOD活性的动态变化

不同日龄雏鸡血清中SOD含量结果见表3。由表3可知，首免后14 d，APS组中SOD含量极显著高于其他各组，cCHMPSH组显著高于LM组，cCHMPSM组显著高于对照组和LM组;首免后21 d，APS组极显著高于对照组、LM组，显著高于cCHMPSH组和cCHMPSL组，cCHMPSH组、cCHMPSL组显著高于对照组和LM组，cCHMPSM组极显著高于对照组和LM组;首免后28 d，不同多糖组均极显著高于对照组和LM组，cCHMPSM组显著高于APS组和cCHMPSL组;首免后 35 d，各剂量cCHMPS组极显著高于其他各组;首免后42 d，各剂量cCHMPS组极显著高于其他各组，cCHMPSH组和cCHMPSM组显著高于cCHMPSL组。endprint

3 讨论与结论

3.1 LM、APS和cCHMPS对雏鸡红细胞免疫功能的影响

Nelson发现红细胞具有免疫黏附作用[7]后，西方国家随即对其进行了深入研究。1981年Siegel等在前人研究的基础上发现了红细胞的多种免疫功能，提出了“红细胞免疫系

表3 不同处理组SOD含量的动态变化

处理

首免后不同时间SOD含量（pg/mL）

8 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d

cCHMPSH 56.29±2.63aA 67.69±4.34abAB 75.59±4.18bcABC 91.03±2.54bcB 141.27±13.96bB 173.88±8.69cC

cCHMPSM 56.36±2.16aA 68.52±2.88bAB 78.66±2.55cdBC 93.29±3.97cB 154.21±14.59bB 176.22±11.95cC

cCHMPSL 60.64±3.23aA 66.57±2.18abAB 74.40±2.41bcABC 82.75±3.85bB 140.41±10.91bB 144.85±6.82bBC

APS 64.26±4.84aA 82.24±1.79cC 88.66±3.24dC 82.21±4.57bB 77.21±1.77aA 64.48±2.12aA

LM 56.42±2.47aA 57.01±2.65aA 63.62±3.46aA 65.43±2.66aA 67.22±2.36aA 59.32±3.21aA

对照 54.91±4.15aA 57.92±1.83abAB 59.46±1.97aA 60.73±1.11aA 61.45±1.37aA 59.60±2.70aA

统”的概念[8]，从而更新了人们对红细胞功能的认识，促进了红细胞免疫研究工作的迅速发展。众多研究表明，红细胞具有清除循环免疫复合物、增强吞噬细胞的吞噬功能、调控T淋巴细胞和淋巴因子、识别、储存和提呈抗原等作用[9-10]。红细胞的这些免疫功能主要是通过免疫黏附来实现，红细胞膜上的CR1（即C3b受体）是免疫黏附的物质基础，因此判断红细胞免疫功能的主要指标为CR1活性。郭峰在红细胞免疫的基础理论和应用研究方面取得了许多突破性进展，建立了一系列红细胞免疫功能的监测方法[5]。目前常用C3b受体花环试验、红细胞免疫复合物（IC）花环、血清红细胞免疫黏附促进因子测定等方法测定红细胞膜上CR1活性。研究表明，许多中药复方制剂和多糖可显著提高红细胞免疫水平[11-13]。本试验发现，高、中、低剂量一定纯度中药复方多糖、黄芪多糖组与对照组相比，均能提高雏鸡红细胞-C3b受体花环率和红细胞-IC受体花环率，增强红细胞膜上C3b活性，并且中剂量一定纯度中药复方多糖组的效果最佳。而盐酸左旋咪唑组与对照组相比无明显差别，原因可能是盐酸左旋咪唑具有促进免疫细胞增殖，增强机体抗体水平等免疫调节作用，而对红细胞无明显免疫调节作用。

3.2 LM、APS和cCHMPS对雏鸡抗氧化能力的影响

动物机体在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基，它们独立存在含有1个或多个不成对电子或分子[14]。正常情况下，机体内活性氧自由基的产生和消除保持着一种动态平衡，当该平衡一旦被打破，机体内急剧积累的氧自由基便会对细胞产生巨大的破坏作用，使核酸主键断裂、氢键破坏、蛋白质失活和降解，脂质发生过氧化等[15]，导致细胞坏死、细胞程序性死亡、过敏反应、癌变或其他病理过程[16]。SOD是活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，它能将超氧物阴离子自由基快速歧化为过氧化氢（H2O2）和分子氧，之后H2O2在过氧化氢酶（CAT）、各种过氧化物酶（如APX）和抗坏血酸谷胱甘肽循环系统的作用下转变为水和分子氧，在保护细胞免受氧化损伤过程中具有十分重要的作用[17]。血液中SOD活性的高低可间接反映机体清除活性氧自由基的能力，用来衡量机体抗氧化作用的大小。试验证明，植物多糖能通过提高体内抗氧化酶活性来发挥抗氧化作用[18]，左旋咪唑能通过在体内的代谢产物（d）-2-氧-3（-2-硫乙基）-5-苯丙硫咪唑啉（OMPI）与活细胞内的氧化产物结合，清除活性氧自由基，起到保护细胞的作用[19]。本试验结果表明，高、中、低剂量一定纯度中药复方多糖、黄芪多糖与对照相比，均能显著提高雏鸡血清中SOD含量。表明纯化后的中药复方多糖和黄芪多糖均具有明显抗氧化活性，本结论与徐小芳等报道的中药复方多糖和黄芪多糖均能显著升高血清中SOD含量，提高鸡抗氧化能力的试验结果[20]一致。而盐酸左旋咪唑对雏鸡血清中SOD含量影响不大，可能其抗氧化机制与代谢产物OMPI有关，而与提高机体SOD含量无关。

本试验通过LM、APS和cCHMPS对红细胞免疫功能和SOD活性的比较，验证了中药多糖能够通过增强红细胞免疫黏附力和SOD活性提高机体抵抗病原的能力。总体而言，各剂量一定纯度中药复方多糖，尤其是中剂量一定纯度中药复方多糖的免疫增强效果均优于黄芪多糖，表明中药复方多糖各组分间有协同增效作用，可大大提高中药复方多糖的免疫活性，多糖的生物活性不是剂量越大越好，提高剂量并不能增强其免疫活性。

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