汞暴露所致小鼠肾毒性的实验研究

黎丽 陈春帆 梁韬 苏敏

(1.环境监测站，广西北流市环保局，广西 北流 547400；2.环境监察大队，广西北流市环保局，广西 北流 547400；3.桂林医学院，广西 桂林 533000；4.广西医科大学，广西 南宁 530021)

汞暴露所致小鼠肾毒性的实验研究

黎丽1陈春帆2梁韬4苏敏3△

(1.环境监测站，广西北流市环保局，广西 北流 547400；2.环境监察大队，广西北流市环保局，广西 北流 547400；3.桂林医学院，广西 桂林 533000；4.广西医科大学，广西 南宁 530021)

目的：研究氯化汞暴露对小鼠肾脏器官及生理功能的影响，并探讨其分子机制。方法：挑选健康雄性KM小鼠随机分为正常对照组(n=8)及低、中、高氯化汞染毒组(ig，1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10 mg·kg-1，n=8)。2周后，计算小鼠体重和肾脏指数变化，检测24 h尿蛋白含量和ELISA法检测血清TNF-α、IL-6的浓度。同时，应用Western blotting法测定肾脏组织内源性NF-κBp50表达。结果：与正常对照组比较，不同浓度的氯化汞染毒小鼠均出现明显的体重减轻和肾脏器官肿大(P<0.01)，24 h尿蛋白含量明显升高(P<0.01)，血清TNF-α、IL-6的浓度显著增高(P <0.01)。而肾脏组织NF-κBp50蛋白表达也显著上调(P<0.01)。结论：金属汞暴露明显诱导小鼠肾脏细胞发生毒性损伤，其机理可能与病理性炎症应激有关。

氯化汞；肾毒性；炎症应激

随着近年经济发展，人类生产活动造成环境来源的汞污染，这些污染源经过生物降解和生物链传送会将重金属汞带入体内，造成神经系统和代谢系统等伤害[1]。重金属汞中毒的临床表现，主要是为头晕、肢体疼痛及麻木、运动失调等神经症状，同时伴有肾炎、肝炎、蛋白尿、血尿和尿毒症等器官损伤病症[2,3]。因此，积极制定防治措施对汞污染管理至关重要。而实施相关的金属汞生物学研究，对其损伤机体器官的机理探讨也将会促进医疗防护及药物治疗的进一步发展。本研究拟体内复制汞中毒小鼠模型，探究氯化汞对肾脏排泄系统的影响及讨论损伤分子机理，为对汞毒性研究提供一定的科学理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

健康雄性KM小鼠，体重20±2 g，由广西医科大学实验动物中心提供。实验小鼠饲养于符合医学实验动物环境设施要求的饲养环境中。试验动物使用许可证SCXK(桂)2007-0001。

1.1.2 药物与试剂

氯化汞(分析纯)：贵州省铜仁化学试剂厂。尿蛋白检测试剂盒和ELISA(TNF-α、IL-6)试剂盒：南京建成生物工程研究所。SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2X)：上海碧云天生物技术研究所。预染蛋白Marker：美国Santa Cruz Biotechnology公司。兔抗鼠NF-κB p50多克隆抗体：美国Santa Cruz Biotechnology公司。辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG抗体：上海碧云天生物技术研究所。超敏ECL化学发光试剂盒：上海碧云天生物技术研究所。

1.1.3 主要仪器

5810型高速低温离心机(德国Eppendorf公司)。722S紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限责任公司)。酶免分析仪(美国Thermo Forma公司)。垂直电泳仪及转膜系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立氯化汞染毒小鼠模型[4]

小鼠适应性饲养1周后，每天罐胃(ig)给予不同浓度的氯化汞溶液(1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10 mg·kg-1)，持续至第14天。

1.2.2 指标检测

末次染毒12 h后，收集小鼠尿液后麻醉(ip，10%水合氯醛)并脱颈椎处死小鼠，分离左侧肾脏并称量，计算肾脏指数=肾湿重/体重。生化试剂盒检查24小时蛋白尿含量，ELISA法检测血清TNF-α、IL-6的浓度。同时，应用Western blotting法测定肾脏组织内源性NF-κB p50表达。

1.2.3 Western blotting检测[5]

准确称量5 mg肾脏组织，加入500 μl RIPA裂解液低温提取目标蛋白。经考马斯亮蓝检测蛋白含量后，取200 ng蛋白在110 V电压下进行SDS-PAGE蛋白分离，再经PVDF转膜，加入脱脂奶粉溶液于摇床孵育1 h。经TBST洗涤3次后，加入稀释后的NF-κB p50一抗(1：1000)于室温2 h，随后加入稀释后的二抗(1：4000)于室温2 h。经TBST洗去抗体后，进行ELC化学发光反应，然后于暗房进行对膜蛋白的显影。对胶片显示的条带进行扫描并采集照片，最后计算目标泳道蛋白的相对密度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 生命体征表现

实验观察显示，氯化汞染毒小鼠精神萎靡，尿量增多生长缓慢及体重明显减轻(P<0.01)。与正常组肾脏比较，氯化汞损伤的肾脏组织有不同程度的损伤症状，如淤血肿大、组织粘连、萎缩等，而肾指数明显增加(P<0.01)，见表1。

表1 氯化汞染毒小鼠体重与肾指数的变化±SD, n=8)

注：与正常对照组比较，*P<0.01。

2.2 氯化汞染毒小鼠尿蛋白含量增加

检测结果显示，氯化汞染毒小鼠明显升高尿液中蛋白的含量，其浓度均高于正常对照(P<0.01)。此外，增加的趋势表现为剂量依赖方式，见表2。

表2 氯化汞染毒小鼠24h蛋白尿的变化

注：与正常对照组比较，*P<0.01。

2.3 氯化汞染毒小鼠血清TNF-α、IL-6水平增加

血清学检查数据发现，氯化汞染毒小鼠血液中的促炎症因子TNF-α、IL-6水平明显升高，其含量均多于正常对照(P<0.01)，见表3。

表3 氯化汞染毒小鼠血清TNF-α、IL-6含量的变化

注：与正常对照组比较，*P<0.01。

2.4 氯化汞染毒小鼠肾脏中NF-κB p50蛋白上调

由Western blotting检测数据表明，氯化汞染毒小鼠肾脏组织中内源性NF-κB p50蛋白表达明显增加，其水平均高于正常对照(P<0.01)。此外，上调的趋势表现为剂量依赖方式，见表4。

表4 氯化汞染毒小鼠肾脏中NF-κB p50蛋白表达的变化

注：与正常对照组比较，*P<0.01。

3 讨论

近年来，由于社会活动而导致环境中的重金属浓度逐渐上升，并超出阈值范围，其结果会直接危害人体健康及导致环境生态恶化[6]。其中重金属汞及其化合物被归纳剧毒物质，进入生态系统后经积累、迁移于人体内蓄积诱发临床病症[7]。因此，我们应该重视了解重金属对人类及环境所造成的潜在危害，同时提高环保意识。此外，开展科学实验研究重金属对体内的毒性机制可为医疗防护及药物研发提供新思路。本实验成功建立氯化汞染毒小鼠模型，进而重金属汞离子对体内脏器的毒性分子机理。结果显示氯化汞染毒小鼠体重减轻，肾脏肿大及明显升高的尿蛋白，表明金属汞进入体内后影响营养物质的生物利用，肾肿大则提示金属汞损伤肾细胞。

研究发现，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种经典的促炎症细胞因子。作为内源性致热原，其负调节体内免疫细胞的功能[8]。炎症发生时，TNF-α常常会发生异常表达。细胞因子白介素6(IL-6) 参与激活与调节免疫细胞，同时在炎症反应中起重要的促进作用[9]。因此，体内的促炎症细胞因子的表达情况可以反映机体的炎症应激病情。实验发现，氯化汞染毒小鼠血清中TNF-α、IL-6含量较正常对照有着明显的升高趋势，提示炎症因子的异常增多可能来自损伤肾组织的释放，其实验结果与尿蛋白上升及肾肿大相符合。我们推测汞离子损伤肾细胞结构，促使组织免疫调控失调而造成炎症因子积累，进一步加重肾损伤。

生理功能上，核因子活化B细胞κ轻链增强子(NF-κB)指DNA转录蛋白复合体，其主要作用是参与靶细胞对外源应激、细胞因子、自由基等生理反应[10]。一旦细胞内NF-κB调控失常，将快速启动对炎症应激，加重细胞损伤。生理机制上，激活的NF-κB经脱离复合体后转移到细胞核内，并特异性结合到DNA的反应元件序列，启动下游效应蛋白的事件，如炎症反应和免疫攻击[11]。实验发现，氯化汞染毒小鼠肾脏组织中内源性的NF-κB 50蛋白明显上调，提示金属汞激活了肾脏细胞NF-κB炎症通路，并诱导炎症因子基因编程，造成炎症因子的释放，其结果与血清增高的促炎症因子水平相符合。因此，我们推测氯化汞诱导的肾毒性与激活NF-κB炎症通路相关，从而造成肾脏细胞损伤。

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Experimental study of mercury exposure-induced renal toxicity in mice

Li Li1, Chen Chun-Fan2, Liang Tao4, Su Min3△

(1.Environmental Monitoring Stations Municipal Environmental Protection Bureau of Beiliu of Guangxi, 547400;2.Environmental Monitoring Unit, Municipal Environmental Protection Bureau of Beiliu of Guangxi, 547400;3.Guilin Medical College, Guangxi Guilin 541004;4.Guangxi Medical University, Guangxi Nanning 530021)

Objective：To study the effects of mercury bichloride exposure on kidney tissue and physiological functions in mice, and to explore the molecular mechanism. Methods: Selection of healthy male KM mice were randomly divided into four groups:normal control group(n=8) and the low, medium and high mercuric chloride-treated groups(ig, 1 mg·kg-1, 5 mg·kg-1, 10 mg·kg-1; n=8). At the end of 2 weeks, body mass and kidney index of mice were measured; 24 h proteinuria content was detected, and serum concentrations of TNF-α, and IL-6 were determined using ELISA method; in addition, endogenous NF-κBp50 expression in the kidney was assessed by Western blotting assay. Results: Compared with normal control, treatment with different concentrations of mercuric chloride in mice showed marked weight loss and kidney enlargement(P<0.01); 24 h proteinuria concentration was significantly elevated(P<0.01); serum TNF-α, IL-6 concentrations were increased(P<0.01); intrarenal NF-κBp50 protein expression was also significantly upregulated(P<0.01). Conclusions: Metallic mercury exposure significantly induced cytotoxicity in renal cells, which the mechanism may be related to development of pathological inflammatory stress.

Mercury bichloride; Renal toxicity; Inflammatory stress

黎丽，女，助理工程师，主要从事环境监测和污染物处理，Email：lili_beiliu@163.com。

△通讯作者：苏敏，女，讲师，主要从事机体毒理与药理学，Email：sumin_guilin@163.com。

2015-1-18)