二甲双胍联合奥沙利铂对肺癌裸鼠移植瘤VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6和 β-catenin表达的影响

陈玉琴，陈刚

(河北医科大学第三医院，石家庄050051)

肺癌目前位于全世界癌症死亡原因的首位，侵袭和转移是导致肺癌预后差、生存期短的主要原因，因此探索靶向作用于肿瘤转移相关因子的抗肿瘤药对晚期肺癌患者的治疗有重要意义。近年研究发现，应用二甲双胍可减少糖尿病患者恶性肿瘤发生风险［1～6］，抑制肿瘤细胞生长，增强化疗药物的作用。2012年6月～2013年7月，我们观察了二甲双胍联合奥沙利铂对肺癌裸鼠移植瘤血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)、CD44变异体蛋白6(CD44v6)和 β-链蛋白(β-catenin)表达水平的影响，从而在分子方面探讨其作用机制，期望能为肺癌的治疗提供新的思路和策略。

1 材料与方法

1.1 材料 BALB/c雄性裸小鼠33只，体质量0～24 g，周龄4～5周，实验动物合格证编号:SCXK京-204-0004，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。在IVC环境中，应用灭菌纯净水以及无菌饲料饲养。人肺腺癌细胞株A549为北京大学医学部赠送。奥沙利铂注射液(深圳海王药业有限公司)，二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司)。VEGF-C兔抗人单克隆抗体(抗体使用浓度均为1∶200)购自博士德公司，VEGFR-3鼠抗人单克隆抗体(抗体使用浓度均为1∶200)、CD44v6鼠抗人单克隆抗体(抗体使用浓度为1∶300)、β-catenin鼠抗人单克隆抗体(抗体使用浓度均为1∶200)、DAB及兔二抗均购自北京中杉公司。RNA保存液购自TIAN GEN公司，Transzol及反转录试剂盒均购自北京Trans Gen Biotech公司，2x UltraSYBR Mixture试剂盒购自CWBiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及接种 将人肺腺癌细胞株A549置于37℃、5%CO2培养箱中，使用含12%进口胎牛血清的F12k培养基培养。取处于对数生长期的A549细胞，制成单细胞悬液，用血细胞计数板进行计数，调整细胞密度为1×107/mL。用1 mL注射器在裸鼠左侧腋部皮下接种上述细胞悬液0.2 mL。

1.2.2 裸鼠分组与处理 使用游标卡尺测量肿瘤结节的长径(a)、短径(b)，按公式 V=a×b2/2，估算肿瘤近似体积。待移植瘤平均直径约5 mm后，剔除肿瘤体积最小的1只裸鼠，成瘤时间为细胞种植后5～8 d，接种后第12天，肿瘤直径平均4 mm。采用随机数字表法将裸鼠随机分为对照组、二甲双胍组、奥沙利铂组、联合用药组各8只。奥沙利铂组给予奥沙利铂注射液，剂量为10 mg/(kg·次)，腹腔注射，每周给药1次，同时口服灭菌蒸馏水;二甲双胍组给予二甲双胍，剂量为200 mg/(kg·d)，灌胃给药，同时腹腔注射等量生理盐水;联合用药组给予二甲双胍200 mg/(kg·d)，灌胃给药以及奥沙利铂10 mg/(kg·次)，每周1次腹腔注射给药;对照组口服等量灭菌蒸馏水，腹腔注射等量生理盐水。给药42 d，处死裸鼠后留取肿瘤组织，肿瘤组织部分置于含RNA保存液的EP管中，液氮冻存;部分置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.3 免疫组织化学法检测 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6和β-catenin蛋白的表达水平 将剥取的肿瘤组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡2次，浸蜡2次，石蜡包埋。免疫组织化学染色采用SP法。结果判定:VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin阳性表达产物位于细胞质中，CD44v6阳性表达产物位于胞膜，呈棕黄色判定为阳性。先在100倍光镜下对组织切片全面观察，随后于200倍光镜下，随机观察10个视野，以北航真彩色病理图像分析系统计算平均积分光密度值(OD值)。

1.2.4 荧光定量RT-PCR法检测VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6和β-catenin mRNA的表达水平 目的基因引物的合成:引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下:GAPDH上游引物:5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物:5'-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3';VEGF-C上游引物:5'-CAATCACACTTCCTGCCG-ATG-3'，下游引物:5'-GGTCTTGTTCGCTGCCTGA-3';VEGFR-3上游引物:5'-GCAGACCCACACAGAACTCT-3'，下 游 引 物:5'-TCGCTGGATGCCGTTGTT-3';CD44v6上游引物:5'-GGAGCCAAATGAAGAAAATGAA-3'，下游引物:5'-TGAAATGGTGCTGGAGATAAAA-3';β-catenin上游引物:5'-TTACACCCACCATCCCACTG-3'，下游引物:5'-GCACGAACAAGCAACTGAACTA-3'。组织总RNA提取:在冰浴匀浆器中加入50 mg肿瘤组织提取RNA，提取成功后放置－80℃保存备用。检测RNA的纯度及含量，用紫外分光光度计测量 OD260/OD280，选用 OD260/OD280为 1.8 ～2.0 的 RNA 用作反转录，RNA含量采用紫外分光光度计检测法。cDNA第一链合成:42℃反转录50 min，95℃、5 min灭活反转录酶。Syber Green荧光定量PCR检测:PCR热循环参数:95℃、10 min，然后三步反应:95℃、15 s，58 ℃、20 s，72 ℃、27 s，进行 40 个循环，于每个循环的第3步72℃、27 s收集荧光信号。扩增完毕后，以GAPDH为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(RQ值)。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量数据以±s表示，比较行单因素方差分析，两两比较采用SNK法。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 二甲双胍以及奥沙利铂对裸鼠人肺癌移植瘤生长的影响 接种42 d后各组移植瘤体积分别为:对照组 (1 439.63± 97.74)mm3，二 甲双 胍 组(1 022.63±101.97)mm3，奥沙利铂组(944.88±88.18)mm3，联合用药组(715.88±95.97)mm3。二甲双胍组、奥沙利铂组和联合用药组抑瘤率分别为28.97%、34.37% 和 50.27%。联合用药组抑瘤率高于二甲双胍、奥沙利铂组(P均＜0.05)。

2.2 各组 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6 和 β-catenin蛋白及mRNA的表达比较 见表1、2。

表1 各组 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin 蛋白表达比较(±s)

表1 各组 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin 蛋白表达比较(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与联合用药组比较，#P ＜0.05。

组别 n VEGF-C VEGFR-3 CD44v6 β-catenin对照组 8 152.35±12.41 149.85± 7.70 152.10±7.97 149.35± 6.65二甲双胍组 8 143.41± 8.75# 142.16± 7.76# 146.29±4.59# 142.16± 4.77#奥沙利铂组 8 120.09±10.03*# 121.34± 4.75*# 118.84±7.81*# 116.96± 7.65*#联合用药组 8 78.86±10.19* 71.09±11.13* 73.59±9.70* 64.84±12.65*F 79.281 151.275 171.294 164.149 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各组 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin mRNA 表达比较(±s)

表2 各组 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin mRNA 表达比较(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与联合用药组比较，#P ＜0.05。

组别 n VEGF-C mRNA VEGFR-3 mRNA CD44v6 mRNA β-catenin mRNA对照组0.77±0.08 0.76±0.07 0.76±0.07 0.75±0.06二甲双胍组 8 0.74±0.04# 0.72±0.05# 0.72±0.07# 0.69±0.08#奥沙利铂组 8 0.49±0.09*# 0.46±0.09*# 0.51±0.09*# 0.46±0.09*#联合用药组 8 0.31±0.06* 0.27±0.08* 0.31±0.06* 0.25±0.05*F 78.897 81.029 64.100 83.892 P 8 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

肺癌是全球主要的死亡原因，非小细胞肺癌占所有肺癌病例的85%，超过60%非小细胞肺癌患者在诊断时已是晚期或存在转移，并且已无手术机会。因此，迫切需要有新的策略延缓肺癌的进展、改善其生存率，提高患者的生存质量。

近年多项研究显示，二甲双胍可能有降低肿瘤发生率的作用，其机制为①通过ATM-LKB1-AMPK-mTOR途径，直接抑制肿瘤生长［7］;②降低胰岛素及人胰岛素样生长因子-1水平，可能是二甲双胍抑制恶性肿瘤的重要间接机制［8］;③诱导细胞周期停滞和细胞凋亡，并能降低生长因子信号［9］;④降低细胞周期蛋白水平;⑤抑制原癌基因 HER2［10］;⑥抗炎作用;⑦提高T细胞的记忆［11］。二甲双胍可以通过抑制miRNA-222从而抑制肺癌细胞的增殖［12］，还可以通过阻断STAT3磷酸化而抑制白细胞介素-6介导的上皮间叶细胞转化［13］。二甲双胍可以与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂联合应用治疗非小细胞肺癌，减少表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的耐药，延长生存期［14］;还可以提高吉非替尼对肺鳞癌的敏感性［15］。与化疗药物有协同作用，可以增强顺铂的细胞毒性［16］。但关于二甲双胍对于肿瘤转移相关因子作用的研究很少，本文通过研究二甲双胍及与奥沙利铂合用对肿瘤转移相关因子的影响，从而了解其抗肿瘤作用。

VEGF-C经蛋白水解加工后，形成以二硫键连接的同源二聚体，与相应的受体结合，发挥生物学效应。在正常组织中，VEGF-C是一种特异性促淋巴管生成因子，VEGFR-2表达在血管内皮及淋巴细胞内皮上，而其另一受体VEGFR-3只表达在淋巴细胞内皮上。与VEGF一样，高浓度VEGF-C可刺激血管内皮细胞的迁移和增生，并增加血管通透性。VEGF-C通过与血管内皮细胞内的VEGFR-2受体及淋巴细胞内皮内的VEGFR-3作用进行信号调节。CD44属于一个独特的黏附分子受体家族，参与细胞—细胞和细胞—基质的相互作用、细胞迁移、淋巴细胞归巢、炎症反应和肿瘤的发生。CD44v6的表达可以预测Ⅰ期非小细胞肺癌患者的临床进展及预后［17］。CD44v6在非小细胞肺癌淋巴结转移患者中的表达比无淋巴结转移者增多，另外CD44v6的表达强度也与非小细胞肺癌淋巴结转移存在相关性。β-catenin既是重要的细胞黏附分子和细胞骨架成分，又是 Wnt信号通路中的重要组成部分。βcatenin在发育过程中指导机体的正常发育，在肿瘤细胞中，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。β-catenin可激活MMPs或通过影响E-cadherion复合物的形成促进肿瘤细胞的侵袭和转移;激活其下游靶基因c-myc和cyclinD1调控细胞的凋亡与增殖。

本研究结果表明，与对照组相比，奥沙利铂组和联合用药组 VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin、CD44v6的表达水平下降，二甲双胍组β-catenin、CD44v6的表达水平变化不明显，联合用药组较二甲双胍组及奥沙利铂组VEGF-C、VEGFR-3表达下降。联合用药组较奥沙利铂组β-catenin、CD44v6表达下降。提示二甲双胍可能通过某种机制增强了奥沙利铂的抗肿瘤作用。本研究中，免疫组织化学及荧光实时定量PCR结果显示，二甲双胍与奥沙利铂均可抑制VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin 的表达，且二甲双胍与奥沙利铂联合用药较二甲双胍和奥沙利铂单药抑制作用更加明显，因此考虑两药的联合应用既可降低奥沙利铂的不良作用，又可能在抗肿瘤方面提高疗效。关于二甲双胍联合奥沙利铂对于肿瘤转移相关因子抑制的分子机制有待进一步研究。

［1］Franciosi M，Lucisano G，Lapice E，et al.Metformin therapy and risk of cancer in patients with type 2 diabetes:systematic review［J］.PLoS One，2013，8(8):e71583.

［2］Soranna D，Scotti L，Zambon A，et al.Cancer risk associated with use of metformin and sulfonylurea in type 2 diabetes:a meta-analysis［J］.Oncologist，2012，17(6):813-822.

［3］Wu Y，Liu HB，Shi XF，et al.Conventional hypoglycaemic agents and the risk of lung cancer in patients with diabetes:a meta-analysis［J］.PLoS One，2014，9(6):e99577.

［4］茅晓东，陈国芳，徐书航，等.索拉非尼与二甲双胍对甲状腺未分化癌细胞株的生长抑制作用［J］.中华内分泌代谢杂志，2013，29(7):608-612.

［5］唐曦平，唐国都，方春芸，等.二甲双胍对人胰腺癌细胞株PANC-1生长侵袭影响及其机制的探讨［J］.中华肿瘤防治杂志，2013，20(13):963-967.

［6］郭艳红，黄文君，田晶，等.二甲双胍对人肝癌细胞Bel-7402增殖与凋亡的影响［J］.四川生理科学杂志，2014，36(1):14-17.

［7］Tao R，Gong J，Luo X，et al.AMPK exerts dual regulatory effects on the PI3K pathway［J］.J Mol Signal，2010，5(1):1.

［8］Quinn BJ，Dallos M，Kitagawa H，et al.Inhibition of lung tumorigenesis by metformin is associated with decreased plasma IGF-I and diminished receptor tyrosine kinase signaling［J］.Cancer Prev Res，2013，6(8):801-810.

［9］Egan DF，Shackelford DB，Mihaylova MM，et al.Phosphorylation of ULK1(hATG1)by AMP-activated protein kinase connects energy sensing to mitophagy［J］.Science，2011，331(6016):456-461.

［10］Storozhuk Y，Hopmans SN，Sanli T，et al.Metformin inhibits growth and enhances radiation response of non-small cell lung cancer(NSCLC)through ATM and AMPK［J］.Br J Cancer，2013，108(10):2021-2032.

［11］Pearce EL，Walsh MC，Cejas PJ，et al.Enhancing CD8 T cell memory by modulating fatty acid metabolism［J］.Nature，2009，460(7251):103-107.

［12］Wang Y，Dai W，Chu X，et al.Metformin inhibits lung cancer cells proliferation through repressing microRNA-222［J］.Biotechnol Lett，2013，35(12):2013-2019.

［13］Zhao Z，Cheng X，Wang Y，et al.Metformin Inhibits the IL-6-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition and Lung Adenocarcinoma Growth and Metastasis［J］.PLoS One，2014，9(4):e95884.

［14］Li L，Han R，Xiao H，et al.Metformin sensitizes EGFR-TKI-resistant human lung cancer cells in vitro and in vivo through inhibition of IL-6 signaling and EMT reversal［J］.Clin Cancer Res，2014，20(10):2714-2726.

［15］Ko JC，Chiu HC，Wo TY，et al.Inhibition of p38 MAPK-dependent MutS homologue-2(MSH2)expression by metformin enhances gefitinib-induced cytotoxicity in human squamous lung cancer cells［J］.Lung Cancer，2013，82(3):397-406.

［16］Lin CC，Yeh HH，Huang WL，et al.Metformin enhances cisplatin cytotoxicity by suppressing signal transducer and activator of transcription-3 activity independently of the liver kinase B1-AMP-activated protein kinase pathway［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2013，49(2):241-250.

［17］Afify AM，Tate S，Durbin-Johnson B，et al.Expression of CD44s and CD44v6 in lung cancer and their correlation with prognostic factors［J］.Int J Biol Markers，2011，26(1):50-57.