藤黄健骨片对骨质疏松模型大鼠干预作用实验研究

张庆华，朱克俭，黄 敏，郭喜庚

（1.湖南方盛制药股份有限公司，湖南 长沙 410205；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006）

藤黄健骨制剂已上市应用多年，经临床用药反馈和总结，可用于治疗骨关节炎、骨质疏松症、颈椎病、腰椎间盘突出症等病，中医辨证属肾虚血瘀证者。为探讨该药治疗骨质疏松症的药理作用，基于其以“补肾”为主、兼顾“活血止痛”的治则定位，本研究采用地塞米松肌肉注射和维甲酸灌胃的方法制作大鼠骨质疏松模型，系统观察和评价藤黄健骨片对动物模型的改善作用。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

动物：SD大鼠120只，体质量140～200g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号004202、004528。

药物：藤黄健骨片由熟地黄、肉苁蓉、淫羊藿、鹿衔草、骨碎补、鸡血藤、莱菔子（炒）组成，由湖南方盛制药股份有限公司提供，批号20100303。阳性对照药用依普黄酮片，0.2g/片，由湖北四环制药有限公司提供。

试剂：大鼠雌二醇（E2） 定量酶联检测试剂盒（ELISA Kit for Rat E2），大鼠降钙素（CT）定量酶联检测试剂盒（ELISA Kit for Rat CT），长沙维尔生物科技有限公司进口分装，批号101201。

造模：地塞米松诱导骨质疏松动物模型[1]。①选用SD大鼠，雌雄各半，体质量180～200g，肌肉注射地塞米松1mg/kg，2次/周，空白对照组注射生理盐水，连续6周，诱导形成骨质疏松模型。②分组与给药：造模6周后，按体质量随机分成模型组、依普黄酮片组（阳性药组）、藤黄健骨片低剂量组、中剂量组、高剂量组（低、中、高剂量组）。按表1剂量灌胃给药14天后处理动物。于末次给药1h后取血测定血清钙、碱性磷酸酶、雌二醇、降钙素；处死后取股骨做骨力学测定。

维甲酸诱导骨质疏松动物模型[2]。①取雄性SD大鼠，体质量140～160g，按75mg/kg维甲酸（以1%纤维素溶液配成15%浓度）灌胃，日1次，连续2周后停药。常规饲养，4周后诱导形成骨质疏松模型。②分组与给药：造模4周后，按体质量随机分成模型组、依普黄酮片组、藤黄健骨片低、中、高剂量组。按表2剂量灌胃给药14天后处理动物。于末次给药1h后取血测定血清钙、碱性磷酸酶。

2 结 果

藤黄健骨片对血液生化指标的影响。研究结果显示，与模型组比较，藤黄健骨片高剂量组能提高两种骨质疏松动物模型大鼠血清钙水平，差异有统计学意义（P＜0.05）；依普黄酮片对地塞米松诱导大鼠骨质疏松模型能提高其血清钙水平，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，藤黄健骨片高剂量组和依普黄酮片组的血清碱性磷酸酶水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、表2。

表1 藤黄健骨片对地塞米松诱导骨质疏松模型大鼠血液生化指标的影响 （±s）

表1 藤黄健骨片对地塞米松诱导骨质疏松模型大鼠血液生化指标的影响 （±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

碱性磷酸酶（U/L）空白组 10 / 1.56±0.14 102.90±12.99模型组 10 / 1.39±0.12** 124.50±18.42**依普黄酮组 10 0.1 1.51±0.11△ 107.20±11.50△藤黄健骨低剂量组 10 1.2 1.45±0.11 112.20±14.77藤黄健骨中剂量组 10 2.4 1.50±0.12 110.33±13.58藤黄健骨高剂量组 10 4.8 1.52±0.11△ 106.33±14.38△组别 n 剂量（g/kg）钙（mmol/L）

表2 藤黄健骨片对维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠血液生化指标的影响 （±s）

表2 藤黄健骨片对维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠血液生化指标的影响 （±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

碱性磷酸酶（U/L）空白组 10 / 1.70±0.147 96.90±12.53模型组 10 / 1.55±0.075** 117.90±15.88**依普黄酮组 10 0.1 1.61±0.083 104.60±11.06△藤黄健骨低剂量 10 1.2 1.60±0.083 107.10±9.64藤黄健骨中剂量 10 2.4 1.63±0.084 104.44±13.18藤黄健骨高剂量 10 4.8 1.63±0.063△ 103.11±14.19△组别 n 剂量（g/kg）钙（m mol/L）

藤黄健骨片对血清激素水平的影响。研究结果表明，与模型组比较，藤黄健骨片高剂量组能显著提高大鼠血清降钙素水平；藤黄健骨片中、高剂量组和依普黄酮片组能明显提高血清雌二醇水平，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 藤黄健骨片对地塞米松诱导骨质疏松模型大鼠血清激素的影响 （±s）

表3 藤黄健骨片对地塞米松诱导骨质疏松模型大鼠血清激素的影响 （±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

雌二醇（pmol/L）空白组 10 64.03±6.99 14.00±3.61模型组 10 42.20±7.16** 7.05±1.66**依普黄酮组 10 48.27±7.84 8.61±1.58△藤黄健骨低剂量组 10 46.77±9.32 8.54±1.83藤黄健骨中剂量组 10 49.30±9.48 9.00±2.24△△藤黄健骨高剂量组 10 50.19±8.97△ 9.96±2.89△组别 n 降钙素（pg/mL）

藤黄健骨片对骨力学的影响。实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠的股骨最大弯曲力、抗弯强度与断裂挠度均有显著性降低（P＜0.05）；与模型组比较，藤黄健骨片低、中、高剂量组明显提升雄性大鼠的最大弯曲力；高剂量组能明显提升雌性大鼠的最大弯曲力，藤黄健骨片低、中、高剂量组和依普黄酮片组的抗弯强度、断裂挠度均有显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 藤黄健骨片对地塞米松诱导骨质疏松模型大鼠骨力学的影响 （±s）

表4 藤黄健骨片对地塞米松诱导骨质疏松模型大鼠骨力学的影响 （±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

断裂挠度fbb（mm）空白组n=10组别 性别 最大弯曲力Fbb（N）抗弯强度σbb（Mpa）♀ 137.89±12.70 233.24±18.14** 0.50±0.07*♂ 187.17±21.06**238.01±40.30* 0.45±0.04*依普黄酮组n=10♀ 153.08±12.00 281.84±15.04 0.59±0.06♂ 230.91±21.67 293.04±17.82 0.54±0.07模型组n=10♀ 134.89±11.43 271.02±12.35△△ 0.52±0.05♂ 187.29±33.69 280.15±18.07△ 0.54±0.06△藤黄健骨低剂量组n=10♀ 137.12±9.32 272.76±14.97△△ 0.53±0.05♂ 222.00±28.43△ 276.85±14.99△ 0.55±0.04△△藤黄健骨中剂量组n=10♀ 138.90±15.67 280.66±34.91△ 0.58±0.06♂ 224.10±56.33△ 316.51±36.05△△ 0.57±0.06△△♀ 151.68±5.30△ 290.04±18.15△△ 0.51±0.02♂ 236.76±43.22△ 294.68±13.08△△ 0.55±0.06△△藤黄健骨高剂量组n=10

3 讨 论

骨质疏松症 （osteoporosis，OP）是以骨量低下、骨微结构破坏，导致骨脆性增加，易于发生骨折为特点的全身性骨病。本病分为原发性和继发性两大类，继发性骨质疏松症是指由任何影响骨代谢的疾病或药物所致的骨质疏松症。骨质疏松症是慢性、渐进性、退化性疾病，随着年龄增长，患病风险增加，故一般多见于绝经后妇女和老年男性[3，4]。

骨质疏松症属中医“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”、“骨极”等范畴。《素问·宣明五气》、《素问·阴阳应象大论》提出，“藏真下于肾，肾藏骨髓之气也”，“肾主身之骨髓”。《素问·痿论篇》曰：“肾主身之骨骼，……肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”本病发病多因脾肾亏虚，首责肾虚，其次是脾虚不健，运化不足，气血生化无源，致骨失所养，筋骨不坚，髓枯骨痿；或因老年元气不足，瘀血内阻，气血运行受阻。中医辨证当为本虚标实，临床常见证候有肾虚（肝肾阴虚、脾肾阳虚）、脾虚、血瘀（气滞血瘀、气虚血瘀）；虚则补益，实则通达，补肾为主，标本兼顾，治疗总的组方原则是补肾活血、益气健脾、强筋健骨、舒筋活络[5，6]。

目前常用骨质疏松症动物模型的诱导方法有糖皮质激素、维甲酸、环磷酰胺、酒精、去卵巢等所致者，其他的还有转基因（基因剔除）和脑源性模型。有研究资料表明[7]，长期或大量使用糖皮质激素可以导致骨质疏松且并发骨折，常用药物有地塞米松、强的松等。其发生机制是糖皮质激素可以增加RANKL的表达，下调护骨素（OPG）水平，从而抑制成骨细胞活性，活化破骨细胞，促进骨吸收和局部细胞凋亡，导致骨代谢失衡；且抑制肠钙吸收和骨钙、磷重吸收，抑制肾小管钙的重吸收，促进骨质疏松的形成。此外，致骨细胞自噬可能也是机制之一。维甲酸又称维A酸，是体内Vitamin A的中间代谢产物。本品既有促进成骨细胞增殖和分化的作用，又能增强破骨细胞的骨吸收，且促骨吸收作用占优势，故其总的结果是导致骨量减少，可造成骨形成与骨吸收都活跃的高转换型骨质疏松模型。

选用地塞米松和维甲酸两种方法诱导形成骨质疏松动物模型，观察血液生化指标（钙、碱性磷酸酶）、血清激素水平（雌二醇、降钙素）和骨力学的变化情况。钙是构成骨矿物质的主要成分，其绝大部分都储存在骨组织中。若因钙摄入不足、吸收低下，血钙水平下降，可使甲状旁腺激素（PTH）分泌增多，造成破骨细胞活性加强。碱性磷酸酶与钙一样参与骨代谢，在血液中保持一个稳定的数值。本项实验结果表明，与空白组相比，模型组的血清钙水平明显降低，碱性磷酸酶水平则明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，藤黄健骨片高剂量组能明显提高大鼠血清钙水平，且其血清碱性磷酸酶水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与骨质疏松症发生相关的最重要激素包括雌激素和降钙素。雌激素能抑制骨钙融出，且可增强骨细胞活动，同时还可协助活性维生素D在肾内的合成；降钙素通过与破骨细胞上的降钙素受体结合，抑制骨吸收，同时也可抑制甲状旁腺激素和活性维生素D的活性，降低血钙浓度，促进钙重吸收。实验结果表明，藤黄健骨片高剂量组能显著提高大鼠血清降钙素水平；藤黄健骨片中、高剂量组能明显提高血清雌二醇水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。骨力学是生物力学的重要分支，主要研究骨组织在外力作用下的力学特性和骨受力后的生物学效应，是对骨质量的直接评价，也是评价各种对抗骨量低下和骨强度下降措施的最佳指标之一[8]。骨质疏松症的基本特点就是骨强度下降、骨折风险增加，这与骨的抗外力作用减退有着直接的关系，因此，评价骨的力学特性是研究骨质疏松症的又一个重要指标，包括最大弯曲力、抗弯强度、断裂挠度。本实验采用骨力学作为评价药物干预作用的主要指标之一，结果显示，与模型组比较，藤黄健骨片低、中、高剂量组（雄性）和高剂量组（雌性）的最大弯曲力有明显提高，藤黄健骨片低、中、高剂量组的抗弯强度和断裂挠度均有显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示藤黄健骨片能较好的改善骨力学特性。

藤黄健骨片处方来源于国医大师刘柏龄教授临证经验的总结，是经多年临床应用凝练并研制而成的中药复方制剂[9]。全方用药精炼，共由7味药组成，重用熟地黄为君，滋阴补血，益精填髓；臣药用肉苁蓉、淫羊藿、骨碎补、鹿衔草，分别取其补肾阳、益精血、入肾生髓以治其本，祛风湿、通经络、强筋止痛以治其标，佐以鸡血藤，补血、活血、通经络、强筋骨；使药为莱菔子，消食、理气，以防补而滋腻之弊。诸药配伍，共奏补肾、活血、止痛之功。本项实验研究从探索药物的药理效应角度出发，初步验证了藤黄健骨片治疗骨质疏松症的作用。作为中药复方制剂，其组方配伍和相关的药效物质较为复杂，通过药理学实验把藤黄健骨片的理法方药与现代药理学研究相结合，为药物的临床科学合理使用提供确切的药理学实验数据支持。

[1] 周成刚，周庆来，冯梅梅，等.正骨通痹丸对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨力学的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2009，17（3）：7-8.

[2] 许鹏，郭雄，张银刚，等.维甲酸诱导骨质疏松模型大鼠的效果及机理[J].四川大学学报（医学版），2005，36（2）：229-232.

[3] 中华医学会风湿病学分会.原发性骨质疏松症诊治指南[J].柳州医药，2012，25（3）：188-199.

[4] 孙树椿，孙之镐.临床骨伤科学[M].北京：人民卫生出版社，2014：1154-1157.

[5] 谢雁鸣，宇文亚，董福慧，等.原发性骨质疏松症中医临床实践指南（摘录）[J].中华中医药杂志，2012，27（7）：1886-1890.

[6] 方朝晖，耿家金，张有志，等.1000例老年性骨质疏松症证候分布与组合规律研究[J].中国中医药信息杂志，2007，14（5）：15-17.

[7] 贾经汉，邱新建，陈志坚.常用骨质疏松动物模型特点的综述[J].广西中医学院学报，2006，7（4）：76-79.

[8] 张红石，高颖，王富春.补虚化瘀针法对骨质疏松大鼠骨力学影响的研究[J].吉林中医药，2009，29（4）：348-349.

[9] 刘柏龄.退行性脊椎炎1000例临床分析[J].辽宁中医杂志，1982，9（3）：40-41.