大鼠原位肾移植管道吻合改良新技术

陈 海,杨亦彬,梁国标,杨 旸,容 松

(1.遵义医学院附属医院 肾内科，贵州 遵义 563099;2.遵义医学院附属医院 泌尿外科，贵州 遵义 563099;3.遵义医学院附属医院 器官移植实验室,贵州 遵义 563099)

技术与方法

大鼠原位肾移植管道吻合改良新技术

陈 海1,杨亦彬1,梁国标2,杨 旸1,容 松3

(1.遵义医学院附属医院 肾内科，贵州 遵义 563099;2.遵义医学院附属医院 泌尿外科，贵州 遵义 563099;3.遵义医学院附属医院 器官移植实验室,贵州 遵义 563099)

目的 建立一种改良的大鼠原位肾移植模型，评价其可靠性和稳定性。方法 采用同体移植，以Sprague Dawley(SD)大鼠作为供、受体，手术技术采用原位移植法，血管及输尿管各采用新式吻合法，即供体左肾动、静脉与受体左肾(切除后)动、静脉均行端端连续外翻式吻合，末端不打结。输尿管采用新式端端吻合法，间断缝针。共施行移植手术常规技术组及改良新技术组各20对，记录各期手术时间，术后连续观测体重及肾功能，第28天处死老鼠检查移植肾及吻合口情况。结果 与常规血管吻合技术相比，采用改良新技术的供体手术时间差异无统计学意义，而受体总手术时间明显减少(P<0.05)；移植术后肾功能两者差异无统计学意义；吻合后常规技术组出现2例血管狭窄、1例吻合口出血，而改良新技术组无并发症；术后28 d改良新技术组动、静脉吻合口通畅无狭窄，输尿管吻合口无狭窄和瘘，而常规技术组1例动脉吻合口堵塞、2例输尿管狭窄。结论 采用血管端端连续外翻式无结吻合、输尿管新式端端间断吻合改良新技术，有效避免了吻合口狭窄与瘘，提高了成功率，是一个很好的移植模型。

肾移植;大鼠;动物模型;血管吻合

大鼠肾移植作为常规器官移植模型一直以来被广泛用于移植免疫排斥反应等方面的研究之中。长期以来由于涉及到显微手术，虽然大鼠肾移植方法很多，但均对吻合技术没有实质的改进，因此该移植技术需要初学者大量的练习才能达到实验要求。本文建立改进的血管及输尿管重建新技术，使得该模型能在较短的时间内熟练掌握，而且成功率高，并发症明显降低，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 采用6～8周无特定病原体级雄性SD大鼠80只，体重200～250g，均购自第三军医大学动物中心(合格证号：ScXK渝20111009)，在本校实验中心常规饲养3 d以上以稳定情绪。大鼠分为两组，常规技术组与改良新技术组各做20对肾脏移植。

1.2 手术器械 立式手术显微镜(德国Leica公司,M220F12)，异氟醚小动物麻醉机(美国Matrx公司，VMR)，高频电凝器(沪通，GT35-T)，自制恒温手术床，医用无损伤针带线(10-0,8-0,2-0丝线)，15mm显微血管夹(德国Braun公司，FE780K)，其它常规显微手术器械。

1.3 手术方法

1.3.1 供体采摘 异氟醚气体麻醉后腹部手术区剃毛，仰卧位固定于恒温手术床上，消毒后沿腹部正中线剪开皮肤，从剑突至耻骨联合，拉钩拉开皮肤，温湿纱布覆盖肠管并向大鼠右侧轻推，充分暴露左侧肾脏区域，以棉签钝性分离肾动、静脉附近结缔组织，电凝离断左肾上腺血管分支和精索内静脉，至少游离出肾动、静脉5 mm。用血管夹夹住肾动脉上的主动脉，剪开下腔静脉一个小口，从肾动脉下的主动脉插入套管针向左肾灌注冰生理盐水5 mL直至肾脏完全发白，然后尽量靠近主动脉及下腔静脉开口处剪断左肾动、静脉。接着游离输尿管，注意保护好输尿管滋养血管，游离后从下三分之一段剪断输尿管。最后锐性剪开肾脏与周围组织至完全游离左肾及血管、输尿管，放在冰盐水中保存待用。

1.3.2 受体准备 同供体一样麻醉、剪毛、消毒开腹、保护肠管、显露左肾区域，钝、锐性分离左肾动、静脉约5 mm长以及输尿管，凝断小血管分支，尽量靠近主动脉及下腔静脉开口处用15 mm血管夹夹闭左肾动、静脉，尽量靠近肾门处剪断动、静脉，从中段剪断输尿管，完全切除自体左肾。将供体肾放入左侧肾窝，仔细修剪各吻合口端，去除脂肪，剪直吻合口边缘待吻合。

1.3.3 血管吻合 轻轻拉动供、受体肾动脉端对端对齐，采用8-0线，先将两肾动脉作两端缝合打结吊线，再用下端的针带线在前壁作连续缝合，具体针法是：从供体肾动脉外壁穿入，从受体外壁穿出，再从供体外壁穿入，从受体外壁穿出，如此重复，结果动脉前壁共缝合4针。翻转肾脏，动脉后壁和前壁一样作连续缝合共4针，最后尾线和吊线打结，而改良新技术组则采用连续外翻缝合，具体针法是：从受体肾动脉外壁穿入，从供体外壁穿出，再从同侧供体外壁穿入，从受体外壁穿出，再从同侧受体外壁穿入，从供体外壁穿出，如此重复，结果动脉前壁共缝合4针(见图1)。翻转肾脏，动脉后壁和前壁一样作连续外翻缝合共4针，最后保留尾线5 mm长不和吊线打结。将肾脏翻回原位，轻轻拉动供、受体肾静脉端对端对齐，仍用8-0线，将两肾静脉作两端缝合打结吊线，用下端的针穿入供体静脉腔，于腔内行静脉后壁常规连续缝合7-8针，最后一针穿出受体静脉壁出来，再在腔外行前壁常规连续缝合7-8针，常规技术组最后一针穿出后尾线与吊线打结，而新技术组则保留1 cm不和吊线打结。吻合结束后，用棉签轻轻压住吻合口，放开血管夹，然后慢慢放开棉签，可见移植肾即刻充血、红润。若见吻合口仍有出血，可再度加压片刻直至出血停止。采用改良新技术后若吻合口过宽或过窄可拉动两侧吊线调节吻合口大小。

A:常规技术(连续缝合)；B:改良新技术(连续外翻缝合)。

1.3.4 输尿管吻合 移植肾复灌后数分钟，即可见输尿管有尿液流出。将两输尿管拉直，剪去供体输尿管过长部分，使两输尿管无张力自然对准且不扭曲。使用10-0线间断吻合输尿管，常规技术组吻合法先作两端吻合吊线，再在前壁用常规方法间断缝合两针，然后牵拉两端吊线，使输尿管翻转暴露后壁，最后用常规方法间断缝合后壁两针，再翻回输尿管呈自然状。改良新技术组则在每次缝合输尿管时均从内壁进针、外壁穿出，其它过程和常规技术组相同(见图2)。

A:常规技术;B:改良新技术。

1.3.5 术后处理 管道吻合完毕，仔细检查移植

肾供血情况、吻合口无扭曲狭窄、无出血后，还原肠管。结扎右侧肾蒂，切除右肾。常规关腹，待老鼠苏醒后放入笼中烤灯保温，常规饮食饮水。

1.4 记录指标 分别记录各期手术时间，术后连续观测移植鼠体重及肾功能，第28天处死老鼠检查移植肾及吻合口情况。

2 结果

2.1 移植术中情况 供体手术耗时：常规技术组13.2±2.5 min，改良新技术组13.4±2.3 min，两组差异无统计学意义(P>0.05)；受体手术总时间：常规技术组为45.5±7.8 min，而新技术组为38.3±6.9 min，两组差异具有统计学意义(P<0.05)；吻合口开放后常规技术组出现2例血管狭窄、1例吻合口出血较多(>200 μL)，而改良新技术组无明显并发症；两组输尿管吻合均未发现漏尿及明显堵塞。

2.2 术后受体大鼠一般情况 术后全部大鼠苏醒时间为3.1±1.5 min，术后围手术期均存活，两组手术成功率均100%。术后第28天处死老鼠，开腹检查见新技术组动、静脉吻合口通畅无狭窄，输尿管吻合口无狭窄和漏尿，而常规技术组1例动脉吻合口堵塞(肾色发白)、2例输尿管狭窄致近端输尿管膨胀、肾盂中度积水。

2.3 术后连续观测受体大鼠体重(见表1) 两实验组在术后体重均下降，然后缓慢持续增加，呈正常生长状态，比较两组体重变化，除第3周(P<0.05)外其它时段差异无显著性(P>0.05)。

表1 受体大鼠体重(g)变化情况(n=20)

组别术前术后第1天术后第7天术后第14天术后第21天术后第28天常规技术组198．8±4．7186．4±11．4210．3±11．2262．9±13．1315．9±27．5∗359．7±36．7改良新技术组200．3±4．5190．4±10．5213．5±10．6265．4±12．8321．8±24．2∗363．6±33．6

与常规技术组比较，*P<0.05。

2.4 受体大鼠术后肾功能 分别于术前及术后第1、7、14、21、28天取眼球后静脉血，测量血清肌酐(见图3)，可见两组术后第1天肌酐均接近130 μmol/L，各自与术前比差异有统计学意义(P<0.01)。两组间比较，两周内差异无统计学意义(P>0.05)，第3周及第4周，常规技术组血清肌酐值较改良新技术组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图3 大鼠移植术后血清肌酐变化情况

3 讨论

建立动物移植模型一直是研究排斥反应的重要手段之一[1]，而这其中大鼠肾移植模型使用最早[2]且最为广泛[3]。相比大中型动物移植模型，大鼠肾移植最容易出现的并发症是出血、血栓和输尿管堵塞及尿漏。国内外已有众多移植技术改良的文献报道。多数技术涉及吻合部位的选择、是否使用袖套、补片、套管[4-5]等设计，而忽略了吻合过程中用针的具体技巧。本模型即针对常见的并发症采用新的管道吻合技术，提高了手术成功率和移植物使用质量。

首先在血管吻合时采用端端吻合，和常用的端侧吻合技术[5]相比，减少了对受体下肢缺血的影响，提高了成功率[6]。在动脉端端吻合时，常规多用间断缝合[7-8]，主要原因是连续吻合容易导致动脉狭窄。本模型在血管吻合中使用两项新式技术：一是连续吻合，但每次都是同侧外壁穿出再穿入，这样能保证两血管壁是外翻的，可以减少血栓形成的机会；二是最后一针吻合完毕后不与吊线打结，这样可以在放开血管夹后发现血管狭窄或缝线间距过大导致出血时轻轻拉动两根吊线调整吻合口大小，以解决狭窄及出血问题。本研究组已用该无结技术成功建立小鼠心、肾移植模型[9-11]，而大鼠肾移植首次使用该技术，难度更大，故术中改用8-0缝合线，这样可以利用线本身的粗度压迫缝合间隙减少出血。在静脉端端吻合时，同样使用无结技术，也可以在吻合后拉动吊线调整吻合口大小防止狭窄与出血。这种单纯的缝合方法比使用辅助材料比如内支架技术等方法要耗时短，血管内壁损伤小，极大地降低了血栓形成几率。本实验中改良新技术组没有出现1例血管并发症，而常规技术组出现数例吻合口狭窄与出血，证实了改良新技术的优越。

输尿管端端吻合难度相对较大，因为输尿管管径比血管更粗而内径极小[12]，在显微镜下很难将缝针从外壁穿入内壁，所以本新技术每次进针都选择从内壁穿入外壁穿出，这种吻合进针简单，使缝合变得更加容易，极大地节约了手术时间，而对于输尿管来说因没有血栓风险所以这种缝合技术没有问题，且因能较好地保持吻合间距，而没有出现狭窄；而用10-0线间断缝合6针，也可以保证不会出现尿瘘的情况。这种端端吻合技术与输尿管直接缝入膀胱技术相比更接近自然状态，也避免了因受体膀胱收缩挤压输尿管导致的狭窄。连续28 d观察发现没有1例出现尿瘘及狭窄，证明本改良新吻合技术虽容易导致两侧内外壁无法对齐但结果仍完全成功有效，而常规吻合法有2例狭窄，均因视线不清导致缝线不均匀所致。

采用本模型的管道吻合改良新技术，明显降低血管吻合导致的血栓形成和出血，降低输尿管吻合导致的尿瘘和堵塞，在连续28 d的观察中，大鼠体重恢复好，肌酐降至正常。本技术简单易行，操作可靠，非常适于初学者练习及进阶者使用。

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[收稿2015-01-12;修回2015-03-06]

(编辑：王福军)

New improved technologies of pipeline anastomosis of orthotopic kidney transplantation in rats

ChenHai1,YangYibing1,LiangGuobiao2,YangYang1,RongSong3

(1.Department of Nephrology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. Department of Urology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3. Organ Transplant Laboratory of The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To explore a new operation method for constructing a scalable and reliable orthotopic kidney transplantation in rats. Methods Sprague Dawley rats were used for the orthotopic isogenic transplantation. A new improved technique for anastomosis of vessels and ureter was established. The vessel’s continuous anastomosis was performed in an end-to-end manner between the donor’s and recipient’s left renal vessels after the left donor kidney was removed. Importantly, the last stitch was not tied to the end of the tie. A new end-to-end anastomosis with interrupted stitches by ureter was performed. Twenty transplantation cases were divided into regular technique group and new improved technique group. Operation time and renal function were observed. Rats were sacrificed at 28th Day. The grafts and the stomas were checked.Results Compared with regular technique group, donor operation time had no significant difference, but total recipient operation time was significantly reduced in the new improved technique group (P<0.05). Renal function had no significant difference between these two groups. In the regular technique group, there were two vessel stenosis and one anastomotic blooding after transplantation. But there were no complications in the new improved technique group. Twenty-eight days after transplantation, the arterial and venous anastomosis had good patency and no stenosis in the new improved technique group. There was no ureteral stenosis and anastomotic leak in the new improved technique group. But there were one artery blockage and two ureteral stenosis.Conclusion In this study, with the new improved vascular anastomosis and ureter anastomosis, anastomotic stenosis and leak of vessels and ureter are avoided. The success rate of transplantation is improved. It is a good model for the kidney transplantation in rats.

kidney transplantation;rat; animal model;vessel anastomosis

国家自然科学基金资助项目(NO：81160096)。

杨亦彬,男,博士,主任医师，硕士生导师,研究方向:慢性肾病,E-mail:yyb1011@sina.com；容松,男,博士,教授，硕士生导师,研究方向:移植损伤,E-mail: songrong@hotmail.com。

R699.2

A

1000-2715(2015)02-0197-04