不同双水相提取山药总黄酮的研究*

孙亚琴，王香爱，张 茜

(渭南师范学院 化学与生命科学学院，陕西 渭南 714000)

山药(Chinese Yam)，又名薯蓣、白薯、土薯、薯药，为薯蓣科(Dioscoreaceae)植物署蓣(Dioscorea opposite Thunb)的块茎，为常用中药，它既可以与其它药物配用，也是很好的补益食品。据《神农本草经》记载，山药具有“主治伤中、补虚赢、除寒热邪气，补中益气力，长肌肉，止泄痢，化痰涎，润皮毛，益肾气。久服耳聪目明，经身不饥延年”等功效[1]。现代医学研究表明，山药含有皂苷、粘液质、胆碱、淀粉、多糖、蛋白质、尿囊素、多种氨基酸、维生素、多巴胺和多种矿物质元素，能诱生干扰素，增强机体免疫力，改善冠状动脉及微循环的血流，还具有抗衰老、抗氧化、提高应激力、降血脂、抗肿瘤等功效，是极具营养价值的优良食品[1-2]。

黄酮类化合物是山药的主要活性成分之一，具有多种生物活性，如心血管系统活性、抗菌及抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗氧化自由基活性，抗炎、镇痛活性，保肝活性，此外，大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、泻下、镇咳、祛痰、解痉及抗变态等药理活性[3]。

双水相萃取(aqueous two-phase extraction，ATPE)技术始于20 世纪 60 年代，是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取的一种新型分离技术[4-5]。因该方法分离条件温和、过程易放大、生物亲和性好等优点被广泛应用[5]。常用的分相盐主要有(NH4)2SO4、NaNO3、Na2CO3、Na3PO4、Na2SO4、K2HPO4、NaAc或NaCl等，常用的有机相有甲醇、乙醇、丙醇、聚乙二醇(PEG)等。采用此方法提取山药总黄酮，并研究不同双水相提取黄酮类化合物的效果，为山药的开发利用和发展先进提取分离技术提供了有益的启示。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

磷酸氢二钾:AR，硫酸铵:AR,碳酸钠:AR，西安化学试剂厂；氯化钠:AR,硫酸钠:AR,天津市红岩化学试剂厂；氢氧化钠:AR,亚硝酸钠:AR,成都科龙化学试剂有限公司；硝酸铝:AR,甲醇:AR,聚乙二醇:AR，相对分子质量3 000，北京化学试剂厂；乙醇:AR,天津化学试剂有限公司；芦丁标准品:西安化学试剂厂；山药:购自渭南市临渭区。

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海—恒科学仪器有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司；SHB-III型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；T6新锐-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 总黄酮的提取

取新鲜山药洗净、去皮、切片、低温烘干、粉碎备用。

1.2.1 乙醇-盐双水相提取[6]

取5个小锥形瓶分别加入12 mL水和18 mL无水乙醇使其形成质量分数60%的乙醇溶液，然后分别加入一定量磷酸氢二钾、碳酸钠、硫酸铵、硫酸钠、氯化钠固体，边加边震荡使固体溶解，溶液为无色透明液体，直至产生分相为止。再分别加入1 g山药粉于各双水相中，60 ℃恒温水浴提取2 h，抽滤除去山药渣，滤液于分液漏斗中静置分层，取上层清液，用分光光度法测定ρ(总黄酮)。

1.2.2 聚乙二醇-盐双水相提取[7]

取5个小锥形瓶，分别加入25 mL水及3 g聚乙二醇，摇匀，再分别加入4 g硫酸铵、磷酸氢二钾、碳酸钠、硫酸钠和9 g氯化钠(因为加入9 g氯化钠才分相)，振荡使固体溶解，静置，直至产生分相，再分别加入1 g山药粉，60 ℃恒温浴提取2 h，抽滤除去山药渣，滤液于分液漏斗中静置分层，取上层液，用分光光度法测ρ(总黄酮)。

1.2.3 甲醇-盐双水相提取

取5个小锥形瓶分别加入12 mL水和1 g硫酸铵、磷酸氢二钾、碳酸钠、硫酸钠、氯化钠固体，然后加入18 mL甲醇，摇匀，静置分层，再分别加入1 g山药粉，60 ℃恒温水浴提取2 h，抽滤除去山药渣，滤液于分液漏斗中静置分层，取上层液，用分光光度法测ρ(总黄酮)。

1.3 ρ(总黄酮)的测定

参考文献[8]方法绘制芦丁标准曲线。

对照品溶液的制备：准确称取芦丁对照品0.006 0 g，用体积分数30%乙醇溶液将芦丁溶解，定容到100 mL容量瓶中，摇匀。

标准曲线的绘制：准确吸取0.06 mg/mL 芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL，分别置于50 mL 容量瓶中，各加质量分数5%的NaNO2溶液1.0 mL，混匀，放置6 min；加质量分数10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL，混匀，放置6 min；加质量分数4%的 NaOH 溶液10 mL，再加质量分数30%的乙醇溶液至刻度，摇匀，放置15 min。按照分光光度法在510 nm 波长处，以试剂空白作参比测定吸光度，根据测定的不同质量浓度芦丁对照品溶液的吸光度，绘制出芦丁标准曲线图，得回归方程。

提取物中ρ(黄酮)以ρ(总黄酮)计算，以芦丁为标准，参照绘制芦丁标准曲线的方法，在总黄酮提取液中加入Al(NO3)3溶液，使黄酮化合物与铝盐形成稳定的有色络合物，在波长510 nm 处测定吸光度，用标准曲线法计算ρ(总黄酮)。准确吸取上层提取液2.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，对照组加入蒸馏水2.0 mL，依次各加质量分数5%的NaNO2溶液1.0 mL，混匀，放置6 min；加质量分数10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，混匀，放置6 min；加质量分数4%的NaOH溶液10 mL，再加质量分数30%的乙醇溶液至刻度，摇匀，放置15 min。按照分光光度法在510 nm波长处，以试剂空白作参比测定吸光度。通过回归方程计算出ρ(总黄酮)。总黄酮提取率按下式计算。

提取率=总黄酮质量/样品质量[9]

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

以芦丁对照品的ρ(芦丁)为横坐标，以在510 nm下测得不同的ρ(芦丁)对照品的吸光度为纵坐标，绘制的标准曲线，见图1。

ρ(芦丁)/(mg·L-1)图1 芦丁标准曲线

对图1的数据进行线性回归得芦丁对照品吸光度(A)和浓度(ρ)的方程为：A=0.013 3ρ-0.002 6，R2=1.000 0，线性关系良好。

2.2 各双水相提取山药ρ(总黄酮)

各双水相提取山药ρ(总黄酮)见表1～表3。

表1 乙醇-盐双水相提取的ρ(总黄酮)

表2 甲醇-盐双水相提取的ρ(总黄酮)

表3聚乙二醇-盐双水相提取的ρ(总黄酮)

盐 K2HPO4Na2CO3(NH3)2SO4NaCl Na2SO4吸光度9.92188.40967.66627.00344.9144ρ(总黄酮) /(mg·mL-1)0.74620.63250.57660.52680.3697 提取率/%3.73103.16252.88302.63401.8485

由表1、表2、表3可知碱式或酸式盐形成的双水相提取效果比中性盐的提取效果要好。可能是因为碱式或酸式盐可水解，与水的结合能力较强，且磷酸氢二钾、碳酸钠和硫酸铵在60 ℃时的实际溶解度也比后2种盐大，从而使两相分离的较为明显，提取效果较好。而在前3种盐中，磷酸氢二钾在60 ℃的溶解度最大，同时磷酸氢二钾是高价盐其盐析作用较强，提取效果更好一些。

由表1、表2、表3对比可知，聚合物形成的双水相比低分子有机化合物形成的双水相提取效果较好。可能是因为低分子有机化合物如甲醇、乙醇，与水的亲和能力较强，而不易形成双水相，且在低温加热时甲醇、乙醇易挥发，从而导致提取效果不太好。用高聚物如聚乙二醇形成双水相，可避免上述缺点，而且操作方便。

由以上分析可知山药中含有丰富的黄酮类化合物，用聚乙二醇-磷酸氢二钾双水相体系提取山药总黄酮效果最好，测得样品中ρ(总黄酮) =0.746 2 mg/mL，提取率为3.731 0%。

3 结 论

研究了常用的几种双水相提取山药总黄酮的提取效果，其中在60 ℃时用聚乙二醇-磷酸氢二钾双水相体系提取山药总黄酮效果最好，测得样品中ρ(总黄酮)=0.746 2 mg/mL，提取率为3.731 0%。

双水相萃取技术在微生物、有机化合物的分离和纯化等过程中表现出相当好的性能。其和传统的分离方法(如回流法、盐析、沉淀、有机溶剂萃取等)相比其优势在于实验设备简单、溶剂用量少、几乎不存在有机溶剂残留、分相时间短、分离条件温和、萃取时间短，还避免了超声波、微波等对人体的伤害，并有望用于大规模提取和纯化生物活性物质，因此有很好的应用前景。但仍有一些未能解决的问题，例如双水相的形成机理和活性物质在两相体系间的分配机理尚未完全研究清楚，因此还需对该技术投入大量的研究。

[ 参 考 文 献 ]

[1] 张婧萱,廖保宁,黄锁义.淮山药中总黄酮的提取及对羟基自由基的清除作用[J].微量元素与健康研究,2007,24(1)：44-54.

[2] 赵宏,谢晓玲,万金志,等.山药的化学成分及药理研究进展[J].今日药学,2009,19(3)：49-52.

[3] 刘宁,朱沛沛,李嘉乐.黄酮类化合物提取工艺研究进展[J].饮料工业,2012,15(7)：7-9.

[4] 侯彩霞,姚焕方,全灿.黄酮类天然产物功效成分提取和纯化技术的研究进展[J].上海化工,2012,37(6)：27-31.

[5] 郭辉,张中玉,罗宇倩,等.双水相萃取法分离竹叶黄酮的工艺研究[J].氨基酸和生物资源,2012,34(2)：24-28.

[6] 顾玉娟,彭秧.乙醇-磷酸氢二钾双水相体系萃取测定椒蒿中总黄酮的含量[J].中国酿造,2012,31(8)：156-158.

[7] 吴祥庭,王爱银,周化斌,等.茶叶黄酮类物质的双水相系统纯化及抗氧化研究[J].茶叶科学,2012,32(4)：289-296.

[8] 陈利梅.超声波辅助双水相提取条斑紫菜黄酮类物质及其抗氧化活性研究[J].食品科学,2012,33(4)：41-46.

[9] 张敏娜,朱军,王光辉,等.双水相体系与超声集成提取月季花总黄酮[J].上海医药,2012,33(3)：29-30.