急性肾损伤的治疗新途径：免疫细胞及细胞干预性治疗

何 旭 综述 龚德华 审校



·血液净化·

急性肾损伤的治疗新途径：免疫细胞及细胞干预性治疗

何 旭 综述 龚德华 审校

免疫应答的炎症反应在急性肾损伤(AKI)中扮演着重要角色,其中，中性粒细胞、树突状细胞和调节T细胞是参与AKI炎症反应的重要免疫细胞。以免疫细胞为治疗靶点，通过药物干预和体外循环干预，有望从源头调节病理状态下的炎症反应，从而给AKI的治疗带来突破。本文就参与AKI的重要免疫细胞的功能及细胞干预性治疗进展做一综述。

急性肾损伤 免疫细胞 细胞疗法 选择性粒细胞吸附 多黏菌素B血液灌流吸附

急性肾损伤(AKI)是由于缺血缺氧、药物中毒和脓毒症等原因导致的肾功能在短期内急剧下降的一类疾病,是住院患者尤其是危重症患者死亡率升高的主要原因，其中，需要行肾脏替代治疗(RRT)的严重AKI死亡率高达50%[1]。当原发性因素导致肾功能损伤后，免疫细胞的活化及其后续反应是导致肾功能进一步恶化及持续存在的重要因素[2]。因此,研究AKI中免疫细胞活化及对肾损伤的作用不仅有助深入了解AKI的病理生理过程，还可能为AKI的防治提供新的途径，即细胞干预性治疗。本文拟就参与AKI的重要免疫细胞的功能及针对免疫细胞的体外循环和药物治疗进展做一综述。

参与AKI的重要免疫细胞

AKI发生后有多种免疫细胞[如中性粒细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、CD4+T细胞、调节T细胞(Tregs)等]被活化，参与其中引起肾脏炎症反应，其中起重要作用的包括中性粒细胞、DC和Tregs。

中性粒细胞 有不少证据表明中性粒细胞参与到AKI过程。AKI患者肾组织病理检查中性粒细胞的聚集是常见表现。在小鼠缺血-再灌注损伤(IRI)和顺铂AKI模型中发现，损伤早期即有中性粒细胞聚集，且持续存在，去除中性粒细胞或阻断其作用可减轻肾脏损伤程度[3]。损伤肾组织的趋化作用是中性粒细胞聚集的重要因素。Herter等[4]研究了小鼠脓毒症AKI模型发现，损伤的肾脏上调E选择素、P选择素和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达，加速招募中性粒细胞，阻断CD1b、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、E选择素、P选择素则可减轻脓毒症肾损伤。聚集在损伤肾脏的中性粒细胞通过两方面作用进一步加重肾脏损伤：(1)活化的中性粒细胞向肾脏受损部位聚集，局部血管内皮细胞的损伤及活化，导致其在肾脏管周毛细血管中淤滞，中性粒细胞与内皮细胞相互作用导致血管通透性增加，使液体从血管内渗漏至组织间隙，发展为低血容量，同时使肾组织间隙静水压升高，进一步影响其血供；(2)激活的中性粒细胞释放蛋白酶颗粒、活性氧(ROS)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素17(IL-17)、趋化因子CXCL1等多种促炎细胞因子，进一步加重肾脏损伤[5]。因此中性粒细胞是AKI免疫功能紊乱发生、发展的主要参与者。

树突状细胞(DC) DC 不仅参与固有免疫应答，还作为最强大的抗原提呈细胞激发适应性免疫应答，起到放大AKI后炎症反应的作用。研究表明,DC在IRI后释放IL-12和IL-23，通过下游效应分子IFN-γ 和IL-17活化招募巨噬细胞和中性粒细胞，起到放大免疫反应作用[5]。Dong等[6]发现IRI后肾脏DC释放细胞因子和趋化因子，包括肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)，预先去除DC可减轻IRI后肾脏TNF的表达。IRI前去除DC可减轻肾脏损伤和功能障碍，发挥肾脏保护作用[7]。DC还可表达共刺激分子CD40，通过非经典主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ类分子)激活NKT细胞[8]。

DC表面存在腺苷受体A2AR，激活后可抑制DC活化，干扰DC进一步通过CD1d激活NKT细胞，从而减轻炎症反应。腺苷是ATP和AMP的降解产物，有抗炎作用，其生成增加或降解减少均可抑制DC活化。动物实验显示，阻断小鼠DC表面A2AR后肾脏损伤加重，使用选择性A2AR激动剂ATL313后则起组织保护作用[9]。

调节T细胞(Tregs) Tregs是AKI病理过程中起抗炎作用的免疫细胞，它能减轻AKI肾脏损伤程度，并促进损伤后修复。Tregs以细胞因子依赖和非细胞因子依赖两种机制发挥免疫负调节作用。Tregs抗炎机制：(1)分泌IL-10、转化生长因子β(TGF-β)、IL-35等抗炎因子，抑制肾脏IRI早期固有免疫应答，IL-10基因敲除后Tregs肾保护作用消失；(2)通过淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)等表面分子与DC细胞接触，抑制DC活化[10]。Monteiro等[11]发现预先祛除Tregs，加重72h后小鼠IRI，而补充外源性Tregs则可减轻小鼠缺血再灌注和顺铂AKI[12]。Tregs还可促进肾损伤恢复，Gandolfo等[13]发现去除Tregs导致AKI损伤修复延迟，死亡率增加，IRI 24h后补充外源性Tregs可促进AKI大鼠肾功能恢复。理论上，提高Tregs功能或者增加Tregs数量均可减轻AKI肾损伤。

细胞干预性治疗的应用进展

如前文所述，免疫细胞活化及其所引发的级联反应在AKI中起重要作用。针对这些细胞进行干预，在动物实验中显示可减轻或加重肾脏损伤。这也为AKI的临床治疗提供了新的途径。目前有望用于临床的细胞干预性治疗主要两种手段，一是通过药物干预免疫细胞功能，二是通过体外循环方法干预。

药物治疗 碱性磷酸酶(ALP)是一种着眼于促进腺苷生成、用于脓毒症AKI治疗的新型药物。它通过将细胞在低氧和应激状态下释放的ATP和AMP(促炎介质)降解为腺苷来发挥抗炎作用；此外还可使脂多糖(LPS)脱磷酸化来降低其毒性。动物实验和临床Ⅱ期实验均证实，ALP可改善脓毒症AKI的肾功能[14]。Pickkers等[15]报道了一项前瞻性随机双盲安慰剂对照的ALP临床Ⅱa期研究，纳入脓毒症或脓毒症休克同时合并AKI的危重症患者36例，发现ALP治疗组内生肌酐清除率更高，肾功能改善更明显，肾脏替代时间更短，同时C反应蛋白(CRP)，IL-6、脂多糖结合蛋白(LBP)等系统性炎症指标更低，尿液中AKI标记物KIM-1、IL-18水平更低。

基于Tregs的肾脏保护作用，很多研究以Tregs为靶点致力于治疗AKI的药物开发。目前已有研究证实补充外源性体外扩增Tresg的安全性和可行性，并尝试将此项技术应用于AKI的临床治疗。除了外源性补充Tregs，理论上，促进内源性Tregs增殖、活化和向损伤部位转运均可发挥肾脏保护作用。鞘氨醇激酶抑制剂(DMS)可使Tregs在小鼠IRI后迅速迁移至损伤组织起肾脏保护作用，这种作用通过CTLA-4下调DC的共刺激分子来实现，阻断CTLA-4后作用消失[16]。

虽然目前尚无以免疫细胞为靶点治疗AKI的药物通过最终的临床验证，但仍将是治疗AKI药物研发的热点和希望所在。

体外循环细胞干预性治疗 通过体外循环方法，针对活化免疫细胞进行干预，以达到减轻受损组织损伤程度的治疗目的。目前应用于临床的包括以下两种方法。

选择性粒细胞吸附(SCD) SCD技术产生于生物型人工肾相关研究中。生物型人工肾在传统血液滤过装置的基础上串联含肾小管上皮细胞的生物反应器，称为肾小管辅助装置(RAD)[17]。在一项RAD的Ⅱ期临床试验中发现,与传统的血液滤过相比，RAD显著提高28d生存率；但在随后的一项Ⅱb期临床试验的中期分析却发现,使用不含细胞的RAD的对照组生存率远高于RAD组，试验随即叫停[18]。进一步研究发现，这种不含细胞的RAD装置可滞留、吸附循环中的粒细胞，通过调节固有免疫改善预后，并将之称为SCD。至此根据是否含有肾脏细胞，RAD分裂为2项技术：细胞治疗和细胞加工，分别以SCD和生物型人工肾脏上皮细胞系统(BRECS)为代表。

SCD在CRRT基础上增加了一个空心纤维滤器，串联在CRRT滤器后，使用枸橼酸抗凝(图1)。与传统滤器中血液在空心纤维内流动不同，SCD中血液是在空心纤维外流动，在内流动的是滤液[18]，这种改变使得血流的剪切力较在空心纤维内流动时的剪切力100 dyne/cm2极大降低，至接近于毛细血管(<1 dyne/cm2)水平；在低剪切力条件下，活化中性粒细胞和单核细胞更易结合在空心纤维膜的外壁。同时使用的枸橼酸抗凝使得滤器血液中离子钙<0.4 mmol/L，从而进一步抑制中性粒细胞激活，且中性粒细胞随后以凋亡状态返回至全身循环中[19]。据认为SCD即通过这种吸附和灭活粒细胞作用，来达到调节固有免疫功能，减轻器官损伤的治疗效应。

图1 选择性粒细胞吸附示意图

SCD治疗模式的相对简单、可实现性及可能的治疗效应激起了人们对其进一步研究的兴趣。近期动物实验报道，在大肠杆菌诱导猪的脓毒症AKI模型中，SCD联合枸橼酸降低了全身中性粒细胞活化，减少活化的白细胞在肺中的聚集，减轻了全身毛细血管的渗漏和肾脏损害，有利于维持心输出量和平均动脉压，延长生存时间[20]。临床研究亦有3项评估了SCD治疗AKI的效果。2010年，Humes等[18]的随机对照研究观察到采用枸橼酸抗凝的SCD治疗较肝素抗凝明显降低的死亡率，从而提示使用枸橼酸抗凝造成的体外循环局部低离子钙环境是SCD调节免疫功能改善预后的重要环节。2011年，Ding等[21]报道一项前瞻性非随机对照的单中心研究，纳入9例AKI合并多器官功能障碍(MODS)的患者，将SCD面积从1.0 m2增至1.4 m2，治疗时间也从72h延长至7d。采用PICARD研究中配对患者作历史对照(死亡率78%)，发现SCD组死亡率明显降低(22%)，治疗7d尿量明显增加，未发现严重不良反应。随后美国发起了一项关于SCD的多中心研究[22]，采用历史对照，评估SCD治疗ICU中AKI的安全性和有效性。SCD的聚砜纤维面积增至2.0 m2。纳入35例患者，平均SOFA评分为11.5，其中脓毒症AKI占80%。这组患者28d、60d死亡率分别为20%和31%，与传统RRT相比，死亡率降低约50%。与既往传统RRT相比，这组患者24h内呼吸功能改善率增加、48h内升压药物用量减少，72h内尿量增加，RRT治疗时间缩短为4.3d(传统治疗RRT时间>7d)。

这些探索性的研究显示SCD安全性好，临床疗效突出，无白细胞减少和持续的血小板减少症发生。当然，SCD的有效性还有待于更大规模的多中心随机对照研究来验证。

多黏菌素B血液灌流吸附(PMX-DHP) PMX-DHP针对内毒素进行吸附的治疗，在脓毒症休克患者治疗中取得较好效果。而对其疗效机制的研究则发现，它的主要作用并非完全由于内毒症吸附从而降低细胞因子水平，更多可能还在于对活化免疫细胞的去除。治疗后循环中活化的中性粒细胞表面分子发生改变， C-X-C化学因子受体1 (CXCR1)和CXCR2表达上调，同时下调CD64，CD11b表达。一项研究显示PMX-DHP并不改变脓毒症患者细胞因子IL-6、IL-8、IL-10及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)水平，但在采用脓毒症患者的血进行体外PMX-DHP灌流120 min后，中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞下降78%，70%及10%。流式细胞仪检测显示，活化中性粒细胞(伴高水平CD11b、CD64表达及低水平CXCR1、CXCR2表达)大量黏附在吸附柱上。经过灌流处理的血液分离出的中性粒细胞对体外培养内皮细胞损害较小，而其吞噬Ecoli的能力则未受影响[23]。显示其选择性清除血液中活化中性粒细胞，减轻其对内皮细胞损害，改善系统性炎症反应。

相较于动物实验中所述药物干预完全去除某种细胞的方式，体外循环细胞干预性治疗选择性清除活化免疫细胞，保留了正常非活化细胞，有助于保持患者必要的正常免疫功能，避免从免疫亢进变为免疫低下。由于此项技术处于起步阶段，主要是针对活化中性粒细胞的干预，今后研究方向将是研制针对其他活化的免疫细胞的干预性治疗措施。

小结：既往血液净化治疗更多着眼于从循环中清除溶质以改善预后，随着人们对AKI，特别是脓毒症相关AKI中免疫细胞作用的认识深入，一种新的血液净化概念被提出，即体外循环细胞干预性治疗，同时相关的一些临床实践及研究也已开展，初步结果显示了较好的效果及潜在的应用价值。这些新的理念及治疗方法的提出，也可能改变目前AKI治疗中单纯支持及替代治疗的窘境，有望开启AKI治疗的新局面。

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(本文编辑 逸 沐)

Novel approaches for acute kidney injury:immune cells and cell-based technologies

HEXu，GONGDehua

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases，JinlingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicine，Nanjing210002，China

Inflammation plays a central role in acute kidney injury (AKI)， involves cells of both the innate and adaptive immune systems, in which neutrophil, dendritic cells and regulatory T cells contribute to the systematic inflammation.So to take the immune cells as the target with the medicine therapy and the extracorporeal approach will improve the prognosis of patients with AKI.In this view, both immune cells and associated treatment will be discussed.

acute kidney injury immune cells cell-based technologies selective cytopheretic inhibitory device direct hemoperfusion through Polymyxin B

国家自然科学基金面上项目(81470992)

南京军区南京总医院肾脏科 国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)

2015-01-13