乙肝病毒全S蛋白反式激活蛋白1在膀胱癌组织中的表达分析

林丽华 ，吴秀珍 ，黄绍娥 ，卓德祥 ，涂文瑞

(1、福建医科大学附属三明第一医院检验科，福建三明365000；2、三明市中西医结合医院检验科，福建三明365000)

膀胱癌有非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌两种类型。这两种类型的膀胱癌有着不同的分子改变，并且临床预后也不相同[1]。前者发病率较高，约占膀胱癌患者总数的70%，对生命威胁较小，但却因易复发需要定期复查，对患者造成巨大的经济负担；浸润性膀胱癌发病率较低，占临床上膀胱癌总数的30%，但其往往更容易发生远处转移而导致不良的临床后果[2]。为深入研究膀胱癌在分子水平的改变，我们用基因芯片分析两种类型膀胱癌的基因表达谱，结果显示乙肝病毒全S蛋白反式激活蛋白 1(complete S transactivated protein 1，CSTP1)[3]在膀胱癌组织表达较癌旁组织明显降低,信息学分析显示CSTP1 mRNA编码一个分子量36kDa的蛋白磷酸酶催化亚单位结构域(protein phosphatase 2A catalytic unit，PP2Ac)。 为进一步验证基因芯片结果，我们用RT-PCR及免疫组化方法检测CSTP1基因mRNA及蛋白在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达差异，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 RT-PCR 提取膀胱癌及癌旁组织总RNA，反转录合成cDNA第1链，上下游引物：5'-ACA TCC ACT CAA ACG CTC ACC-3'和5'-ACA CAT GGG GAT TAT GGG GAT-3'，扩增 CSTP1 基因(140bp)。

1.2 抗体制备 合成IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA多肽抗原，将多肽抗原与完全弗氏佐剂充分混合乳化后进行首次皮下、皮内多点注射。将不完全弗氏佐剂与抗原混合，于第14、24、35d进行加强免疫。末次加强免疫后6d耳缘静脉取血进行抗体特异性测定。末次取血后5d心脏取血，分离血清并亲和层析纯化。

1.3 质粒构建 RT-PCR法扩增CSTP1基因ORF全长(引物 1：5'-AA GGA TCC AAC TCG CTC GCC ATG TCG-3'; 引物 2：5'-AA GAA TTC CTT TTT TCT TGA TCA AAT CCA TGA GAT C-3'),克隆入pGEM-T-easy质粒，双向测序正确后亚克隆入pcDNA3.1myc/his C质粒，所得质粒命名为pcDNA3.1myc/his C-CSTP1。

1.4 蛋白免疫印迹 pcDNA3.1myc/his C-CSTP1质粒转染人胚肾293T细胞，48h后，提取细胞总蛋白，Bradford法蛋白定量。80V电压电泳，200mA恒流转膜1.5h,脱脂牛奶室温封闭1h，加1:2000稀释的兔抗CSTP1多克隆抗体，4℃孵育过夜，第2天，TBST洗涤3次，加二抗。TBST洗3次后显色、曝光。

1.5 免疫组化染色 甲醛固定后石蜡组织切片经二甲苯脱蜡、分级酒精水化后，3%过氧化氢室温封闭内源性过氧化酶活性15min，在10mmol/L EDTA(pH 8.0)中高压热修复3min，兔抗CSTP1抗体(1:200)4℃孵育过夜,EnVision两步法系统检测CSTP1的表达。

2 结果

2.1 CSTP1 mRNA在膀胱癌组织中表达明显下调我们用RT-PCR方法检测CSTP1 mRNA在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达，RT-PCR结果显示，CSTP1 mRNA在膀胱癌组织表达较来源于同一病人的癌旁组织明显降低。见图1。

图1 CSTP1 mRNA在膀胱癌组织中表达明显降低

2.2 多克隆抗体制备及鉴定 DNA star软件分析CSTP1的蛋白氨基酸序列显示，CSTP1蛋白第213氨基酸至第232氨基酸之间的多肽(IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA)具有良好的抗原性、疏水性并可能位于蛋白表面，适合于作为制备多克隆抗体的免疫原。我们将此多肽合成并与KLH连接后形成所需抗原，与完全弗氏佐剂充分混合乳化后进行皮下、皮内多点注射新西兰大白兔，将不完全弗氏佐剂与抗原混合，充分乳化后于第14、24、35d进行加强免疫。末次加强免疫后6d耳缘静脉取血进行抗体特异性检测。末次取血后5d心脏取血，分离抗血清并亲和层析纯化。为检测制备的多克隆抗体的特异性，我们把pcDNA3.1myc/his CCSTP1及对照空质粒转染293T细胞，提取细胞总蛋白，Western Blot检测CSTP1蛋白的表达。Western结果显示，转染了pcDNA3.1myc/his CCSTP1质粒组细胞在36kDa分子量处有一特异信号带，该结果验证了制备的多克隆抗体具有良好的特异性。见图2。

图2 293T细胞中CSTP1蛋白表达

2.3 免疫组化分析CSTP1蛋白在膀胱癌组织中的表达 基因的表达调控具多水平性，mRNA表达减少并不一定代表执行功能的蛋白质的表达降低，我们用制备的多克隆抗体检测CSTP1蛋白在膀胱癌组织中的表达，免疫组化结果显示，CSTP1蛋白产物在非浸润性膀胱癌及浸润性膀胱中表达均较癌旁组织明显降低。见图3。

图3 CSTP1蛋白在膀胱癌组织中的表达

3 讨论

蛋白磷酸酶催化已经磷酸化蛋白质发生去磷酸化，并进而调节蛋白分子的生物活性，其与蛋白激酶相对应存在，共同调节磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质翻译后修饰机制。目前研究人员至少已经发现500多种蛋白激酶，如Akt[4-6]、Ras[7，8]、BRAF[9,10]、PIM-1[11,12]等 ， 并 且 对 蛋 白 激 酶 的 功能，尤其在人类肿瘤发生发展过程中的作用进行了深入的研究，但对于去磷酸化的磷酸酶，研究人员的认识不论从种类还是其功能都很肤浅。有研究显示,在人类肿瘤中蛋白磷酸酶往往具有抑制肿瘤发生发展的特性,如PTEN[13,14],PP2A[15]等。我们前期基因芯片结果显示CSTP1在膀胱癌组织表达较癌旁组织明显降低,信息学分析显示CSTP1 mRNA编码一个分子量36kDa的PP2Ac。

然而，基因芯片虽然具有高通量的优点，却存在着假阳性的缺点。为了验证基因芯片结果的可靠性，我们用RT-PCR及免疫组化方法检测CSTP1基因mRNA及蛋白在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达，结果显示，膀胱癌组织CSTP1基因在mRNA及蛋白质水平表达均较癌旁组织明显降低，提示CSTP1可能是一个抑癌基因，其低表达可能参与了膀胱癌的发生发展过程。

在本研究中，我们用RT-PCR和免疫组化方法检测了CSTP1在膀胱癌组织中的表达，成功制备了兔抗CSTP1多克隆抗体，为进一步研究CSTP1对膀胱癌细胞的增殖、周期、凋亡的影响及其分子机制铺垫了基础。

[1]Mitra AP,Datar RH,Cote RJ.Molecular pathways in invasive bladder cancer:New insights into mechanisms,progression and target identification[J].J Clin Oncol,2006,24:5552-5564.

[2]Luo J,Manning BD,Cantley LC.Targeting the PI3K-Akt pathway in human cancer:rationale and premise [J].CancerCell,2003，4257-4262.

[3]Bai GQ,Liu Y,Cheng J,et al.Transactivating effect of complete S protein of hepatitis B virus and cloning of genes transactivated by complete S protein using suppression subtractive hybridization technique[J].World J Gastroenterol，2005，11(25):3893-3898.

[4]Fresno Vara JA,Casado E,de Castro J,et al.PI3K/Akt signalling pathway and cancer[J].Cancer Treat Rev,2004,30(2):193-204.

[5]Jia W,Chang B,Sun L,et al.REDD1 and p-AKT over-expression may predict poor prognosis in ovariancancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(9):5940-5949.

[6]Cheng H,Shcherba M,Pendurti G,et al.Targeting the PI3K/AKT/mTOR pathway:potential for lung cancer treatment.Lung Cancer Manag,2014,3(1):67-75.

[7]Chen M,Gu J,Delclos GL,et al.Genetic variations of the PI3KAKT-mTOR pathway and clinical outcome in muscle invasive and metastatic bladder cancer patients[J].Carcinogenesis，2010，31(8):1387-1391.

[8]Lin J,Wang J,Greisinger AJ,et al.Energy balance,the PI3KAKT-mTOR pathway genes,and the risk of bladder cancer[J].Cancer Prev Res,2010,3(4):505-517.

[9]Lee SH,Ahn BK,Baek SU,et al.BRAF mutation in multiple primary cancer with colorectal cancer and stomach cancer[J].Gastroenterol Rep,2013,1(1):70-74.

[10]Brustugun OT,Khattak AM,Tromborg AK,et al.BRAF-mutations in non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2014,84(1):36-38.

[11]Block KM,Hanke NT,Maine EA,et al.IL-6 stimulates STAT3 and Pim-1 kinase in pancreatic cancer cell lines[J].Pancreas,2012,41(5):773-781.

[12]Zhang T,Zhang X,Ding K,et al.PIM-1 gene RNA interference induces growth inhibition and apoptosis of prostate cancercells and suppresses tumor progression in vivo[J].J Surg Oncol,2010,101(6):513-519.

[13]Choucair K,Ejdelman J,Brimo F,et al.PTEN genomic deletion predicts prostate cancer recurrence and is associated with low AR expression and transcriptional activity[J].BMC Cancer,2012,12:543.

[14]Kou XX,Hao T,Meng Z,et al.Acetylated Sp1 inhibits PTEN expression through binding to PTEN core promoter and recruitment of HDAC1 and promotes cancer cell migration and invasion[J].Carcinogenesis,2013,34(1):58-67.

[15]Li W,Gong F,Chen Z,et al.Down-regulated expression of PP2A catalytic subunit in pancreatic cancer cells promotes cell growth[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2014,94(2):86-89.