ALDH2在白藜芦醇改善大鼠慢性酒精性肝损伤中的机制＊

黄丙清，邱 香，王林枝，朱腾世，郭琰芳，郝丽萍

华中科技大学同济医学院公共卫生学院营养与食品卫生学系，武汉 430030

ALDH2在白藜芦醇改善大鼠慢性酒精性肝损伤中的机制＊

黄丙清，邱 香，王林枝，朱腾世，郭琰芳，郝丽萍△

华中科技大学同济医学院公共卫生学院营养与食品卫生学系，武汉 430030

目的 探讨酒精代谢酶乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶2（ALDH2）在白藜芦醇（resveratrol，Res）改善大鼠慢性酒精性肝损伤中的机制。方法 采用含酒精的Lieber－DeCarli液体饲料喂养大鼠19周，建立慢性酒精性肝损伤模型。42只SD大鼠随机分成正常对照组，低、中、高剂量酒精组，Res对照组，高剂量酒精＋Res组。采用苏木精－伊红（HE）和油红O染色，观察肝组织形态学改变；采用试剂盒测定肝组织中ADH、ALDH2的活性；Western blot检测肝组织中ADH与ALDH2的蛋白表达。结果 各剂量酒精组大鼠肝组织脂肪变性和炎症浸润明显，体重和能量摄入量与正常对照组相比下降，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；且肝组织ADH活性与蛋白表达略有升高，而肝组织ALDH2活性与蛋白表达显著下降。Res干预后大鼠肝组织脂肪变性和炎症浸润均较高剂量酒精组显著减轻，体重与能量摄入量增加，显著提升了肝组织中ALDH2的活性与蛋白表达（P＜0.05）。结论 Res可能通过对大鼠肝脏ALDH2的调节来改善慢性酒精摄入引起的肝脏损伤。

酒精性肝损伤； 白藜芦醇； 乙醇脱氢酶； 乙醛脱氢酶2

酒精是全世界最常被滥用的物质之一，长期的慢性酒精摄入会导致酒精性肝损伤。酒精性肝损伤的发病机制比较复杂，酒精在肝脏内代谢产生的毒性代谢产物及其引起的代谢紊乱是导致酒精性肝损伤的重要原因之一［1］。调节酒精代谢酶的变化，对减少酒精在肝脏内代谢产生的毒性代谢产物及其引起的代谢紊乱都起着重要作用［2］。白藜芦醇（Resveratrol，Res）是中药虎杖的主要成分之一，具有抗癌、抗心血管疾病、抗突变、抗菌、抗炎、抗氧化、诱导细胞凋亡及雌激素调节等多方面有益人类健康的生物药理活性［34］。有研究报道Res对过氧化氢、四氯化碳、酒精等所致的肝损伤有保护作用［57］，但具体涉及的保护机制各不相同，并且有关Res对慢性酒精摄入诱发酒精性肝损伤过程中酒精代谢酶的变化鲜有报道。故本研究采用含酒精的Lieber－DeCarli液体饲料喂养大鼠建立慢性酒精性肝损伤模型，同时给予Res干预，研究Res对大鼠酒精性肝损伤的保护作用以及对酒精代谢酶乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶2（ALDH2）的影响，为进一步探讨Res防治酒精性肝损伤的作用机制提供实验资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

白藜芦醇（Res，纯度98%，南京泽朗生物有限公司）；95%食用酒精（天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙醇脱氢酶（ADH）活性检测试剂盒以及考马斯亮蓝蛋白测试盒（南京建成生物公司）；乙醛脱氢酶（ALDH2）活性检测试剂盒（美国Bio－Vision公司）；ADH抗体、ALDH2抗体和β－actin抗体（美国Abcam公司）；辣根过氧化物标记的抗兔／鼠二抗（美国CST公司）；多功能酶标仪（美国Bio－Tek公司）；荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；5804－R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；蛋白成像分析系统（英国Syngene公司）。

1.2 动物模型建立与分组

1.2.1 实验动物 雄性Sprague－Dawley大鼠42只，体重（180±10）g，购于上海西普尔－必凯实验动物有限公司。大鼠饲养于室温（22±2）℃；湿度50%～70%的环境中。

1.2.2 饲料配方 基础饲料由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供；Lieber－DeCarli液体饲料购自北京华阜康生物科技有限公司，液体分为:不含酒精的对照组液体饲料和含酒精的模型组液体饲料，具体成分见表1。

1.2.3 动物分组及处理 大鼠适应性喂养1周，前3d给予普通的基础饲料，后4d给予不含酒精的对照组液体饲料，待大鼠适应了这种液体饲料后，按体重随机分成6组，即:正常对照组，低、中、高酒精剂量组（0.8、1.6、2.4g／kg），Res对照组，高剂量酒精＋Res组，每组7只。根据前期预实验，定量给予每只大鼠每天100mL液体饲料。正常对照组，喂饲不含酒精的对照组液体饲料；酒精组，喂饲不同酒精剂量的模型组液体饲料，其添加酒精体积根据大鼠的体重换算出，并添加相应的麦芽糊精以达到与正常对照组总供能一致，均提供1kcal／mL的能量，具体方法见表1；Res对照组，喂饲对照组液体饲料＋100mg／（kg·d）Res；高剂量酒精＋Res组，喂饲模型组液体饲料（高剂量）＋100mg／（kg·d）Res。白藜芦醇与酒精剂量的选择依据我们先前的报道。液体饲料每天新鲜配置，白藜芦醇加入液体饲料混匀。每天记录进食量、每周记录体重，喂养19周后处死所有动物，分离并留取肝脏，做病理切片及相关指标检测。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 肝脏苏木精－伊红（HE）与油红O染色 大鼠解剖分离肝脏后，于肝脏左叶最大边缘5mm处取1cm×0.5cm×0.5cm肝脏组织5块，其中1块以4%的多聚甲醛溶液固定，包埋、切片，进行HE染色；1块以无菌滤纸吸净肝脏表面水分和血液后快速冷冻于液氮中用于油红O染色；剩下的3块快速冷冻于液氮中，－80℃冰箱储存备用。每组随机选取3只用于HE染色，7只都做油红O检测。肝脏的病理评分根据肝脏病理切片肝细胞受损程度:脂质评分（1分，1%～；2分，25%～；3分，50%～；4分，75%～），炎性评分（0分，没有；1分，轻度；2分，中度；3分，重度）［8］。

表1 Lieber－DeCarli饲料配方成分表（100mL）Table1 Ingredient list of Lieber－DeCarli formula（100mL）

1.3.2 肝脏ADH与ALDH2活性检测 ADH活性测定根据ADH催化氧化型辅酶Ⅰ反应的原理，通过测定340nm处吸光度的变化率得出其酶活性。ALDH2测定根据醇脱氢酶、辅酶NAD＋和底物在一定温度和pH的条件下反应，通过每分钟波长340nm处吸光度值的变化，计算每分钟NAD＋转化为NADH的量，从而得到该酶的酶活性。ADH与ALDH2活性检测按照酶比色法及相应的试剂盒说明书进行。

1.3.3 Western blot测定ADH与ALDH2的蛋白表达 RIPA法提取肝脏蛋白，改良Lowry’s法测定且调整蛋白浓度后，取45μg蛋白，经10%SDSPAGE凝胶电泳后转至PVDF膜，TBST洗膜，置5%脱脂牛奶封闭2h，将膜置于ADH与ALDH2的一抗后4℃过夜，洗涤后将膜置于相应的二抗后孵育1h，洗膜后加ECL发光试剂，在凝胶成像系统中成像，并对相应的条带进行半定量分析，算出目的蛋白条带与相应的内参比值后与正常对照组相比作为相对蛋白表达。

1.4 统计学方法

所有的数据录入Microsoft Excel 2007，进行数据处理后，用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计量资料以¯x±s表示。多组均数间比较采用单因素方差分析，总体比较差异有统计学意义时采用最小显著法（LSD法，方差齐）或Dunnett T3法，方差不齐）进行组间两两比较。非参数秩和检验用于肝脏病理切片评分比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠的体重与进食量的变化

慢性酒精摄入后，各酒精剂量组大鼠体重、总能量摄入量明显低于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01）。白藜芦醇干预后，与酒精高剂量组相比，大鼠体重得到了提高，且差异具有统计学意义（P＜0.05），总能量摄入有所提高，但差异没有统计学意义。见表2。

表2 大鼠体重与能量摄入量的变化（s，n＝7）Table2 Changes of body weight and energy intake of ratss，n＝7）

表2 大鼠体重与能量摄入量的变化（s，n＝7）Table2 Changes of body weight and energy intake of ratss，n＝7）

与正常对照组比较，＊P＜0.05＊＊P＜0.01；与酒精高剂量组比较，△P＜0.05

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2.2 大鼠肝脏组织的病理变化

从图1A中可以看出光镜下HE染色显示:正常对照组的肝细胞排列紧密，细胞核位于细胞中央，核大而圆，酒精模型组的肝细胞排列疏松，肝细胞中出现了很大的脂肪空泡（图1A中箭头所示），也有很多弥漫性的小脂滴聚集。Res干预后，与酒精高剂量组相比细胞形态得到了改善，很少出现大脂肪空泡，细胞形态也趋于正常。从图1B油红O染色中可以看出，酒精组大鼠肝细胞出现很多红色脂滴，且呈剂量依赖性增加，Res干预后得到了显著性改善。表3给出了各组大鼠肝脏病理切片的脂质评分与炎性评分，低、中、高酒精剂量组切片的脂质评分与中、高酒精剂量组炎性评分显著高于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01），Res干预后肝脏的脂质评分与酒精高剂量组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 大鼠肝脏的脂质评分与炎性评分（平均秩次）Table3 Scoring of hepatic steatosis and inflammation in rats（mean rank）

2.3 大鼠肝脏组织中ADH与ALDH2酶活性与蛋白的表达

慢性酒精摄入后升高了ADH的活性与蛋白的表达，但与正常对照组相比差异没有统计学意义（P＞0.05）；Res干预后，与酒精高剂量组比较略有降低（P＞0.05）。与正常对照组相比，中、高剂量酒精摄入降低肝脏ALDH2酶活性与蛋白表达（P＜0.01或P＜0.05），且呈现剂量依赖性；Res干预后，与酒精高剂量组相比ALDH2酶的活性与蛋白表达得到了升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4，图2。

图1 各组大鼠肝脏组织HE染色和油红O染色切片图Fig.1 HE－（upper，×400）and Oil red O－（bottom，×400）stained liver sections from different rat groups

表4 大鼠肝脏组织中ADH与ALDH2酶的活性与蛋白的相对表达（s）Table4 The activities and the relative protein expressions of ADH and ALDH2in liver tissues of rats（s）

表4 大鼠肝脏组织中ADH与ALDH2酶的活性与蛋白的相对表达（s）Table4 The activities and the relative protein expressions of ADH and ALDH2in liver tissues of rats（s）

与正常对照组比较，＊P＜0.05＊＊P＜0.01；与酒精高剂量组比较，△P＜0.05

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图2 各组大鼠肝脏中ADH与ALDH2蛋白表达Fig.2 Representative pictures of protein expressions of hepatic ADH and ALDH2in each rat groups

3 讨论

肝脏是酒精在体内代谢的主要器官，也最容易受到酒精代谢产物毒性的侵害。酒精及其代谢产物造成肝细胞反复脂肪变性、坏死和再生，导致酒精性肝损伤的发生，进一步可发展为酒精性肝炎、纤维化以及酒精性肝硬化，最终发展为肝癌［910］。

本次研究表明了慢性酒精摄入能够诱发大鼠机体毒性的产生与肝脏脂质的聚集。从表2中可以看出慢性酒精摄入后各酒精剂量组的大鼠体重与总能量摄入量明显低于正常对照组，从各组大鼠肝脏的病理切片可以看出各酒精剂量组出现大量脂肪空泡与脂滴（图1）。此外，各酒精剂量组与正常对照组相比，肝脏的脂质评分与炎性评分得到了显著的提高，进一步揭示了慢性酒精摄入诱导的肝脏脂质聚集与损伤，这也与先前的报道一致［5］。

酒精在肝细胞内首先主要通过ADH与微粒体细胞色素P450（CYP2E1）氧化成乙醛，后者主要在肝脏线粒体内由ALDH2氧化成乙酸而降解［1112］。长期摄入酒精可以使肝脏线粒体功能紊乱［13］，氧化乙醛的能力大大下降，而乙醇的氧化速度不变甚至提高，造成乙醛生成与降解不平衡，导致肝内乙醛含量增加。在本研究中我们发现与正常对照组相比，慢性酒精摄入后肝脏ADH的活性与蛋白的表达略有升高（均P＞0.05），但中、高酒精剂量组ALDH2的活性与蛋白表达显著降低。由于ALDH2是肝脏内清除乙醛的主要酶，因此升高的ADH表达伴随着降低的ALDH2表达，揭示了肝脏乙醛的聚集。聚集的乙醛可以通过与半胱氨酸和谷胱甘肽结合使肝内谷胱甘肽水平下降。肝脏内谷胱甘肽的减少使其抗氧化能力下降，从而有利于其它因素所致的脂质过氧化，导致肝脏损伤［14］。此外乙醛可促进肝星状细胞活化，导致肝星状细胞中的Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白基因表达增加，从而引起细胞外基质在肝内沉积，导致肝纤维化形成［1］。因此，上调ALDH2的表达，将会减少肝脏乙醛聚集，对改善酒精性肝损伤起着重要作用。

在本次研究中我们可以看出Res干预后增加了大鼠的体重和总能量摄入量，改善了各组大鼠肝脏的病理变化（降低了脂质评分与炎性评分），体现了有效的肝脏保护作用，这与先前的部分报道一致［5，1516］。Res的肝脏保护机制已被证实与其强大的生物学活性有关，但具体的机制目前并不清楚。体外的细胞实验发现Res能够提升人外周血淋巴细胞ALDH2mRNA的表达，抑制ADH mRNA的表达，可预防酒精诱导的氧化DNA损伤［17］，提示我们Res具有在基因水平调节乙醇代谢酶活性的潜力。另一方面，我们的研究发现与高剂量酒精组相比，Res干预后对大鼠肝脏ADH活性与蛋白表达没有影响，但显著地升高了肝脏ALDH2活性（P＜0.05）与蛋白的表达（P＜0.05）。提升的肝脏ALDH2活性与蛋白表达，体现了Res具有在蛋白分子水平上调控乙醇代谢酶的潜力，而且高表达的肝脏ALDH2将促使肝脏酒精代谢过程中乙醛的排出，改善了乙醛聚集导致的肝损伤，进一步揭示了Res有效的肝脏保护作用。此外，升高的ALDH2表达可能也间接揭示出Res干预后改善了线粒体功能的紊乱，体现了良好的线粒体保护功能。综上所述，Res对慢性酒精摄入诱导的大鼠酒精性肝损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能与调节ALDH2的酶活性与蛋白的表达有关，但有关Res对ALDH2调节的具体机制需要进一步探讨。

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（2013－12－13 收稿）

Resveratrol Protects against Chronic Alcoholic Liver Injury by Regulating Hepatic ALDH2 Expression in Rats

Huang Bingqing，Qiu Xiang，Wang Linzhi et al
Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To evaluate the protective effects of resveratrol（Res）on chronic alcoholic liver injury in rats and further explore the underlying mechanism involving hepatic ethanol metabolizing enzymes（ADH and ALDH2）.Methods Alcoholic liver injury models of rat were established by feeding Lieber－DeCarli liquid ethanol diet for 19weeks.Forty－two SD rats were randomly divided into normal control group，low－，middle－and high－dose ethanol groups，Res control group and high－dose ethanol＋Res group.The morphological change of hepatic tissues was observed by hematoxylin－eosin（HE）and oil red O staining；the activity of hepatic ADH and ALDH2was determined by using appropriate kits；and the protein expressions of hepatic ADH and ALDH2were detected by Western blot.Results There were serious hepatic steatosis and inflammation in ethanol groups.Body weight and food intake were significantly decreased in the ethanol groups compared with the normal control group.There was moderate increase in the ADH activity and expression and significant decrease in ALDH2activity and expression in ethanol groups.Res could ameliorate ethanol－induced hepatic steatosis and inflammation as well as increase body weight and energy intake.Hepatic ALDH2activity and protein expression were significantly increased by Res treatment（P＜0.05）.Conclusion Res could improve chronic ethanol－induced liver injury by regulating hepatic ALDH2expression.

alcoholic liver injury； resveratrol； ADH； ALDH2

R575

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.007

＊国家自然科学基金资助项目（No.81172657）

黄丙清，男，1989年生，医学硕士，E－mail:244850018＠qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:haolp＠mails.tjmu.edu.cn