活动期幼年特发性关节炎Th17细胞及细胞因子水平的临床价值＊

胡玲娟， 刘燕婕

短篇报道

活动期幼年特发性关节炎Th17细胞及细胞因子水平的临床价值＊

胡玲娟1， 刘燕婕2△

1湖北省卫生计生委综合监督局，武汉 430079
2长江航运总医院检验科，武汉 430010

幼年特发性关节炎； Th17细胞； 细胞因子

幼年特发性关节炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）是儿童期以关节炎为主要特点，伴有关节、皮肤、肌肉组织等全身多系统受累的自身免疫疾病。目前该病的病因和发病机制不明。以往对于JIA病因的认识主要来自遗传、环境和感染等方面。随着分子生物学和现代免疫学迅猛发展，人们对JIA的认识不断增加，有关JIA发病机制的研究也更新了一些观点，其中免疫细胞及其细胞因子在炎症反应中的平衡是非常重要的，是当前关于发病机制的研究热点之一。尤其是CD4＋T细胞及其亚群比率改变在免疫调节中起核心作用［1］。Th17细胞（IL－17 producing T cell）是一种新型的效应性CD4＋T细胞亚群，主要由关键细胞因子TGF－β和IL－6启动初始T淋巴细胞分化形成，通过分泌IL－17等细胞因子发挥其特异性功能效应。越来越多的证据表明［2－3］Th17细胞在多种自身免疫性疾病的发生、发展中发挥着重要作用。Th17细胞分泌特征性细胞因子IL－17、IL－6等炎性细胞因子，在抗胞外菌感染和介导慢性炎症中发挥作用。Th17还特异性针对自身抗原，参与免疫调节，引起自身免疫的病理过程和自身免疫病。本研究分别采用流式细胞术（FCM）和酶联免疫法（ELISA法）检测活动期各型JIA患儿外周血Th17细胞占CD4＋T细胞比率及血清、关节液细胞因子IL－17、IL－6和TGF－β1水平，旨在分析Th17细胞及其相关细胞因子水平变化特点，探讨Th17细胞在活动期JIA患儿关节破坏及其炎症反应中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2009年1月～2013年12月住院确诊的活动期JIA患儿76例（男47例，女29例）为研究对象，其中包括全身型23例，多关节型32例，少关节型21例，年龄5～15岁，平均（7.5±6.5）岁；病程0.5～3年，平均（1.75±1.1）年。诊断标准参照国际风湿病学联盟（ILRA）儿科专家组制定的诊断和分类标准讨论稿［4］。活动期标准为:发热、受累关节肿痛或压痛，关节活动受限，关节活动数≥2。缓解期标准为:无关节肿痛或不伴有压痛的关节活动受限，并除外感染、肿瘤、血液系统疾病及其他风湿性疾病。所有入选病例均伴有膝关节积液。正常对照组:健康儿童49例，男30例，女19例，年龄5～14岁，平均（6.5±6.0）岁；性别、年龄与JIA组匹配（P＞0.05）。

1.2 主要仪器与试剂

FCM检测抗体和试剂用美国Becton－Dickinson公司试剂盒，FACScan流式细胞仪（美国Becton－Dickinson公司），CELLQUEST分析软件（美国Becton－Diclinson公司）。ELISA检测分别用美国R＆D Systems公司人IL－17和TGF－β1酶联免疫诊断试剂盒，比利时Innogentics公司人IL－6酶联免疫诊断试剂盒。全自动酶标仪（美国BIO－TEK宝特ELx800），全自动洗板机（美国伯乐Biorad1575）。

1.3 实验方法

1.3.1 FCM技术检测Th17细胞细胞比率 抽取受试者清晨空腹静脉抗凝血3～5mL，充分混匀，立即处理血液标本。CD4＋T（CD3＋CD4＋CD8－）细胞检测:取未刺激的肝素抗凝全血100μL，加鼠抗人PerCP－抗CD3和FITC－抗CD4／PE－抗CD8抗体20 μL，4℃避光孵育30min，加4mL NH4Cl溶血剂溶血，PBS洗涤2次重悬上机检测CD3＋CD4＋CD8－细胞水平。Th17细胞比率检测:将肝素钠抗凝血与RPMI 1640培养液1∶1比例混匀，于37℃、5% CO2培养箱中培养4h，收集细胞等分测定管和同型对照管，加PerCP－抗CD3抗体和FITC－抗CD8抗体，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，固定液室温避光反应15min后弃去上清液，PBS洗涤2次，加入破膜剂和PE标记抗人IL－17A单抗进行细胞内染色，最后经PBS洗涤2次后上机检测。FCM术按常规操作进行，根据正向散射光和侧向散射光以CD3－SSC设门测定Th17细胞占CD4＋T细胞的比率。

1.3.2 ELISA法检测细胞因子IL－17、IL－6和TGF－β1水平 抽取受试者清晨空腹静脉血3～5mL，离心分离血清，冻存于－20℃冰箱待测。ELISA法作血清细胞因子检测，操作严格按试剂盒说明书步骤进行。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 活动期各型JIA患儿外周血Th17细胞占CD4＋T细胞比率

活动期各型JIA患儿外周血CD4＋T细胞和Th17占CD4＋T细胞的比率均明显高于正常对照组（P＜0.05），见表1。

2.2 活动期各型JIA患儿血清和关节液细胞因子含量

活动期各型JIA患儿血清IL－17、IL－6含量显著高于正常对照组（均P＜0.05），TGF－β1含量增高，但与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。活动期各型JIA患儿关节液中IL－17、IL－6和TGF－β1的含量高于血清水平，但两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 活动期各型JIA患儿CD4＋T细胞和Th17细胞的比率（）Table 1 The proportions of CD3＋CD4＋T cells and Th17cells in children with different subtypes of JIA at active stage（）

表1 活动期各型JIA患儿CD4＋T细胞和Th17细胞的比率（）Table 1 The proportions of CD3＋CD4＋T cells and Th17cells in children with different subtypes of JIA at active stage（）

与正常对照组比较，＊P＜0.05

组别n CD4＋T细胞（%）Th17细胞（%）全身型JIA组23 32.27±8.15＊2.17±0.68＊49 20.56±7.26 0.61±0.13多关节型JIA组32 33.18±8.73＊2.23±0.71＊少关节型JIA组21 31.39±9.17＊1.99±0.82＊正常对照组

表2 活动期各型JIA患儿血清和关节液细胞因子含量（ng／L，）Table 2 The contents of cytokines in the serum and synovial fluid of children with different subtypes of JIA at active stage（ng／L，）

表2 活动期各型JIA患儿血清和关节液细胞因子含量（ng／L，）Table 2 The contents of cytokines in the serum and synovial fluid of children with different subtypes of JIA at active stage（ng／L，）

与正常对照组比较，＊P＜0.05

IL－17IL－6组别n TGF－β1血清关节液全身型JIA组23 12.51±5.33＊13.63±5.17＊9.55±4.47＊10.19±4.64＊210.40±51.26 221.30±55.32血清关节液血清关节液＊多关节型JIA组32 19.09±5.12＊21.79±5.21＊10.61±3.93＊12.66±4.02＊219.30±48.66 227.10±49.45＊少关节型JIA组21 17.18±4.79＊22.27±4.98＊11.54±3.77＊12.65±3.86＊221.40±48.52 230.60±44.63＊正常对照组49 9.95±4.68－5.79±3.15－191.60±39.12－

2.3 活动期JIA患儿血清细胞因子间相关性分析

活动期各型JIA患儿血清IL－17与IL－6水平呈正相关，分别为全身型（r＝0.257，P＜0.05），多关节型（r＝0.316，P＜0.05），少关节型（r＝0.303，P＜0.05）；IL－17与TGF－β1，IL－6与TGF－β1无相关关系。

3 讨论

幼年特发性关节炎（JIA）是儿童期最常见的结缔组织病，也是小儿致残和失明的主要病因，其病因和发病机制仍未完全阐明，已公认除与感染和遗传有关外，免疫紊乱和免疫细胞失衡与JIA的发生密切相关［5］，免疫调节异常、细胞因子产物等因素被认为在JIA发病过程中起重要作用。研究显示［6］前炎症细胞因子广泛参与免疫发病机制，深入研究JIA的免疫功能及其影响因素，将有利于JIA疾病的诊断和治疗。

以往的研究表明［7］CD4＋T细胞亚群失衡对JIA的发生和发展起着关键作用。Th17细胞是源于研究自身免疫病发病机制时发现的CD4＋T细胞新亚群，亦属于前炎症细胞因子家族成员［8］。Th17能诱发产生多种炎症细胞和趋化因子如IL－17、IL－6等，引起强大的炎症反应，与自身免疫性疾病的发生、发展密切相关。研究发现［9］IL－17在自身免疫关节炎中起到介导T细胞激活和骨吸收的作用，参与关节炎发病的起始和骨组织破坏两个阶段。有研究报道［10］IL－17在各型JIA患儿关节滑液中的水平增加，并认为IL－17与JIA关节炎的发生及关节破坏有关。该研究还发现血浆IL－17水平在活动期少关节型和多关节型JIA患儿中增高，与健康对照组比较有显著差异，而全身型活动期改变不明显。这3个亚型缓解期血浆IL－17水平降低，与健康对照组无显著差异，表明在JIA患儿发炎的关节中，表达IL－17的CD4＋T细胞数量增多，且其数量与临床分型有关。IL－17尚和其他炎症细胞因子如TGF－β1、TNF－α共同诱导其他具有炎性活性的基因表达，由此，表明Th17在JIA的发病、关节破坏和炎症反应中起重要作用。

本研究通过对活动期各型JIA患儿外周血Th17细胞占CD4＋T细胞比率及血清、关节液相关细胞因子IL－17、IL－6和TGF－β1的含量检测分析，探讨Th17细胞及相关细胞因子含量改变在活动期JIA中的作用。通过研究Th17细胞在JIA活动期关节破坏及其炎症反应中的作用，初步了解Th17细胞及其相关细胞因子对JIA发病的影响。本研究结果提示活动期JIA患儿T细胞亚群失衡，其外周血CD4＋T细胞和Th17细胞的比率均明显高于正常对照组（P＜0.05）；Th17细胞相关细胞因子可能参与JIA关节破坏和炎症反应过程，其活动期各型JIA患儿血清相关细胞因子IL－17、IL－6水平显著高于正常对照组（P＜0.05），且患儿关节液中细胞因子含量高于其血清水平，但两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本实验研究还显示活动期各型JIA患儿血清IL－17与IL－6水平呈正相关，IL－17与TGF－β1和IL－6与TGF－β1无相关关系。

综上所述，检测JIA患儿Th17细胞及细胞因子水平对JIA诊断和治疗有一定意义。有关Th17细胞及细胞因子在JIA中确切的作用机制，尚需进一步通过多中心、大样本研究获得。随着Th17细胞在JIA疾病研究的不断深入，可推测，Th17细胞及细胞因子将可能成为JIA诊断和治疗的新靶点。

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（2014－09－10 收稿）

R684.3

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.027

＊武汉市卫计委临床医学科研项目（No.WX13C44）

胡玲娟，女，1969年生，主治医师，医学硕士，E－mail:497382775＠qq.com△

，Corresponding author，E－mail:liuyanjie0411＠aliyun.com