OPN和NF－κB在过敏性紫癜患者血清中表达水平的变化及意义

金 汶， 吴 成

OPN和NF－κB在过敏性紫癜患者血清中表达水平的变化及意义

金 汶， 吴 成

湖北医药学院附属随州医院皮肤科，随州 441300

目的 探讨骨桥蛋白（OPN）及核转录因子（NF－κB）在血清中的变化及在过敏性紫癜（HSP）发病机制和疾病进程中的作用。方法 收集湖北医药学院附属随州医院及武汉协和医院皮肤科2012年11月至2013年4月36例经确诊的过敏性紫癜患者血清为实验组，收集40例同龄正常人血清为对照组，通过ELISA技术检测各样本血清中OPN及NF－κB水平。结果OPN和NF－κB在过敏性紫癜患者外周血中的表达均显著高于正常对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），且两者呈正相关（r＝0.59，P＜0.05）。过敏性紫癜肾炎组OPN和NF－κB在患者血清中表达水平均显著高于无肾脏损害过敏性紫癜组（P＜0.05）。OPN与24h尿蛋白定量变化呈显著正相关（r＝0.402，P＜0.05），NF－κB与24h尿蛋白定量变化无相关性（r＝0.185，P＞0.05）。结论 OPN和NF－κB可能参与了过敏性紫癜的发病过程，OPN可能参与过敏性紫癜患者肾脏的损伤。

过敏性紫癜； 骨桥蛋白； 核转录因子

过敏性紫癜（henoch－schonlein purpura，HSP）是一种免疫介导的变态反应性炎症性疾病，其病理特征为涉及的毛细血管和沉积的免疫复合物白细胞破碎性血管炎。首发症状一般表现为皮肤黏膜下压之不褪色的出血性皮疹，常伴有腹痛便血、关节红肿疼痛、关节腔积液、血尿及蛋白尿等临床症状，主要累及皮肤、胃肠道、肾脏、关节等多个器官。如果同时合并有肾脏受累表现，则称之为过敏性紫癜性肾炎（Henoch－Schonlein purpura nephritis，HSPN）。目前过敏性紫癜的病因及发病机制仍未完全阐明。HSP发病机制主要与机体免疫异常，细胞因子和炎症介质的参与，凝血和纤溶机制紊乱及遗传因素有关［1］。

骨桥蛋白（OPN）是一种Th1型细胞因子，目前有很多研究证明OPN在各种炎症和免疫介导的皮肤疾病中扮演重要的角色，可能与OPN可通过免疫细胞相互作用增强辅助Th1介导的免疫反应有关。核转录因子（NF－κB）属于Rel家族，以复合物的形式掩藏它的核定位信号［2］存在于细胞质中。目前很多研究表明NF－κB通过诱导趋化因子、细胞因子、黏附分子基因的蛋白质表达在调节免疫应答和急性期反应中起着至关重要的作用［3］，但在过敏性紫癜中少有研究。本研究通过ELISA技术检测过敏性紫癜患者血清中OPN及NF－κB水平，探讨其在HSP致病过程中的可能作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 血液标本收集与处理

36例过敏性紫癜血样标本均来自湖北医药学院附属随州医院和武汉协和医院皮肤科2012年11月～2013年4月的住院患者，经临床及实验室检查确诊为过敏性紫癜［诊断标准参照《临床皮肤病学（第2版）》（赵辨主编）］。男20例，女16例，平均年龄（10.22±7.02）岁，病程1～7d。对照组为健康体检者40例。两组年龄和性别差异无统计学意义。抽取清晨空腹静脉血10mL置于EDTA抗凝管中。将全血样本10mL分为2份，分别用于检测样本中NF－κB及OPN的浓度，每份5mL。1份置于试管中在4℃低温高速离心机中以3 000r／min，离心15 min，将血清保存于EP管中，放入－80℃冰箱中备用。另外1份全血样本按1∶6加入红细胞裂解液，混匀后在室温下放置5min，在4℃低温高速离心机中以4 000r／min，离心5min（红细胞裂解不完全者重复该步骤1次）后分离出白细胞，贴壁细胞用预冷PBS洗1遍，弃上清留细胞沉淀备用，加入添加苯甲基磺氟（PMSF）的细胞质蛋白和细胞核蛋白抽提液，并提出核蛋白，后置于－80℃冰箱保存备用。

1.2 试剂

96孔人OPN ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，货号:EK0482），96孔抗人NF－κB p65ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，货号:CK－E91032H）。

1.3 方法

采用双抗体夹ABC－ELISA法。将2份标记好的冻存标本取出放置于室温下平衡至少30min，将抗人NF－κB单抗包被于酶标板上，使标准品和样品中的NF－κB与单抗结合，加入生物素化的抗人NF－κB，形成免疫复物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液，30min内应用酶标仪在450 nm处测吸光度（A）值，通过绘制标准曲线计算NF－κB水平。以同样实验方法计算OPN的浓度。

1.4 临床资料收集及整理

收集36例HSP患者详细临床资料:年龄、病程、现病史、既往史、体检结果。记录其实验室检查结果:血常规、尿常规（尿蛋白、尿潜血、尿白细胞数）、24h尿蛋白定量。根据所收集的临床资料及实验室检查将36例过敏性紫癜患者分为无肾脏损害的过敏性紫癜组（20例）和紫癜性肾炎组（16例）。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 OPN和NF－κB在过敏性紫癜急性期及正常人血清中的表达

OPN在过敏性紫癜患者血清中的表达水平（100.46±21.90）×102pg／mL显著高于正常对照组（43.32±29.90）×102pg／mL（t＝4.48，P＜0.05）；NF－κB在过敏性紫癜患者外周血中的表达水平（44.66±10.52）μmol／L亦显著高于正常对照组（18.30±8.90）μmol／L（t＝6.89，P＜0.05），且OPN和NF－κB两者呈正相关（r＝0.59，P＜0.05）。

2.2 OPN和NF－κB在紫癜性肾炎及无肾脏损害过敏性紫癜患者血清中的表达

OPN在过敏性紫癜性肾炎患者血清中表达水平（107.97±16.01）×102pg／mL，显著高于单纯型过敏性紫癜患者（74.20±19.85）×102pg／mL（t＝3.59，P＜0.05）；NF－κB在紫癜性肾炎患者血清中表达水平（47.21±10.39）μmol／L，显著高于单纯型过敏性紫癜患者（35.71±4.42）μmol／L（t＝6.15，P＜0.05）。

2.3 OPN和NF－κB与24 h尿蛋白定量的相关性分析

36例患者24h尿蛋白定量与血清OPN呈正相关（r＝0.402，P＜0.05）。24h尿蛋白定量与血清NF－κB无相关（r＝0.185，P＞0.05），见表1、图1。

表1 过敏性紫癜患者血清中OPN、NF－κB表达及24h尿蛋白定量范围及平均值Table 1 The range of the reference values and the average values of serum OPN and NF－κB levels，and 24hurine protein excretion in HSP patients

图1 过敏性紫癜患者血清中OPN水平与24h尿蛋白定量相关性分析Fig.1 Quantitative correlation analysis of serum OPN levels and 24－h urine protein excretion in HSP patients

3 讨论

过敏性紫癜（HSP）是一种免疫介导的炎症性皮肤疾病，发病机制目前仍未完全阐明，目前很多研究证明辅助性T淋巴细胞亚群的失衡所导致的免疫异常在HSP发病机制中发挥重要的作用［4－5］，可能与Th1／Th2的比例失衡有关。OPN是一种Th1型细胞因子，被认为参与到多种自身免疫性疾病的发病过程中［6］，在Th1介导的免疫反应中扮演重要的角色，可通过影响Th细胞的分化而导致Th1／Th2失衡［7］。核转录因子（NF－κB）属于Rel家族，一般情况下，NF－κB／Rel二聚体与其抑制蛋白IκB（inhibitionκB）结合，以复合物的形式掩藏它的核定位信号存在于细胞质中。在细胞因子如TNF－α和IL－1、细菌和病毒的产物应激等刺激后，Iκκ（IκB激酶）激活使IκB经快速磷酸化、泛素化后降解，而使IκB与NF－κB二聚体解离，使NF－κB被激活回到细胞核内，引起相应靶基因的转录激活或转录抑制。目前很多研究表明NF－κB通过诱导趋化因子、细胞因子、黏附分子基因的蛋白质表达在调节免疫应答和急性期反应中起着至关重要的作用。

本研究发现，过敏性紫癜患者血清中OPN的表达水平显著高于正常对照组，提示OPN很可能参与了过敏性紫癜的发病发展，其机制可能为OPN选择性的上调Th1细胞，促进Th1细胞因子表达而抑制Th2细胞因子表达，并且促进B淋巴细胞增殖和抗体的产生；而OPN高表达促进Th1反应，使Th1细胞因子占优势，并且诱导巨噬细胞产生肿瘤细胞坏死因子－α（TNF－α）、白细胞介素－12（IL－12）、干扰素－γ（IFN－γ）等细胞因子介导炎症反应，导致不可逆的脏器损害，以肾损害最为明显。同时，用ELISA法对36例过敏性紫癜患儿外周血NF－κB检测发现，过敏性紫癜患者外周血中的NF－κB表达显著高于正常对照组，提示NF－κB可能参与了过敏性紫癜的发病过程，其可能机制是NF－κB作为细胞内的一种重要核转录因子可调节树突状细胞（DC）的发育、成熟、抗原提呈及刺激Th细胞的分化等功能［8］。本研究表明过敏性紫癜患者外周血中OPN及NF－κB表达水平呈线性相关，我们推测OPN和NF－κB可能通过调节多种细胞因子的分泌及细胞的分化协同参与了过敏性紫癜的发病过程。有学者研究表明DC的异常是导致HSP患者Th1／Th2失衡的重要因素［9］，但其确切机制尚不清楚。

我们进一步探讨OPN和NF－κB与过敏性紫癜肾损害的关系，研究显示OPN及NF－κB在过敏性紫癜性肾炎患者外周血中表达水平显著高于无肾脏损害过敏性紫癜患者。我们推测OPN和NF－κB可能通过上调炎性因子（TNF－α、IFN－γ、IL－12等）的表达来参与HSP患者肾脏的损害。OPN与HSP患者24h尿蛋白定量呈正相关，但NF－κB与HSP患者24h尿蛋白定量无相关性。我们推测OPN可能是HSP患者是否会发生肾脏损害的一个前期指标，当然这需要我们进一步研究证明。

总之，HSP的发病是多种细胞因子及细胞共同参与的免疫反应，其确切机制我们仍需要进一步的研究。OPN和NF－κB可能参与过敏性紫癜的发病，OPN可能是过敏性紫癜患者是否会发生肾脏损害的一个前期指标，但其发挥的具体机制我们仍不清楚。而检测或调节OPN和NF－κB的水平是否有助于过敏性紫癜病情的判断？调节OPN的水平是否有助于减少过敏性紫癜患者肾脏的损伤？这些问题都有待于我们进一步深入研究。

［1］ 温柠如，张君.过敏性紫癜病因及发病机制的研究进展［J］.实用中医内科杂志，2011，25（7）:45－48.

［2］ 付馨余，邹文进.核转录因子－κB信号通路的研究进展［J］.广东医学，2012，33（19）:2999－3001.

［3］ Coondoo A.Cytokines in dermatology－a basic overview［J］.Indian J Dermatol，2011，56（4）:368－374.

［4］ 蔡洁，胡波.过敏性紫癜发病机制研究进展［J］.国际儿童学杂志，2010，37（1）:39－41.

［5］ Ymg J，Lic R，Zu Y，et a1.Role of regulatory T cells in pathogenesis of Henoeh－Schonlein in children［J］.Chin J pediatr，2006，44（6）:411－414.

［6］ 王有娜，刘光辉.骨桥蛋白在变态反应性疾病中的作用［J］.中华临床医师杂志，2011，5（21）:6402－6404.

［7］ Inoue M，Shinohara M L.Intracellular osteopontin（iOPN）and immunity［J］.Immunol Res，2011，49（1－3）:160－172.

［8］ 陶红，李秋，王莉，等.过敏性紫癜发病中树突状细胞与T辅助细胞分化失衡的关系［J］.第三军医大学学报，2010，32（7）: 677－679.

［9］ Tas S W，de Jong E C，Haiji N，et al.Selective inhibition of NF－kappaB in dendritic cells by the NEMO－binding domain peptide blocks maturation and prevents T cell proliferation and polarization［J］.Eur J Immunol，2005，35（4）:1164－1174.

（2014－11－07 收稿）

Changes of Expression Levels of NF－κB and OPN in the Serum of Patients with Henoch－Schonlein Purpura and Their Significance

Jin Wen，Wu Cheng
Department of Dermatology，Affiliated Suizhou Hospital of Hubei University of Medicine，Suizhou 441300，China

ObjectiveTo explore the changes of pontin（OPN）and nuclear factor－kappa B（NF－κB）in the serum of patients with Henoch－Schonlein purpura（HSP）and their role in the pathogenesis of this disease.Methods The levels of OPN and NF－κB in the serum were measured by ELISA in 36patients who were diagnosed as having HSP between Dec.2012and Apr.2013 in Wuhan Union Hospital，and in 40age－matched normal subjects.Results The expression levels of OPN and NF－κB in the serum of HSP patients were significantly higher than in the normal subjects（P＜0.05）.There was a positive correlation between OPN and NF－κB in HSP patients（r＝0.59，P＜0.05）.The expression levels of OPN and NF－κB in the serum of patients with HSP complicated with nephritis were significantly higher than those in HSP patients without kidney damage（P＜0.05）.There was a significantly positive correlation between OPN and 24－hour urinary protein excretion（r＝0.402，P＜0.05）rather than between NF－κB and 24－hour urinary protein excretion（r＝0.185，P＞0.05）in HSP patients.Conclusion OPN and NF－κB may be involved in the pathogenesis of HSP.OPN may take part in the renal damage in HSP.

henoch－schonlein purpura； OPN； NF－κB

R554.6

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.023

金 汶，女，1963年生，副主任医师，医学硕士，E－mail:jinwensz＠sina.com