Hedgehog信号通路通过E－cad调控SMMC－7721肝癌细胞运动侵袭能力的研究＊

许 凯， 成薇婷

Hedgehog信号通路通过E－cad调控SMMC－7721肝癌细胞运动侵袭能力的研究＊

许 凯1， 成薇婷2△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉 430030
2武汉市第一医院肿瘤科，武汉 430022

目的 探讨Hedgehog（Hh）信号在SMMC－7721肝癌细胞运动侵袭能力中的作用及机制。方法 应用KAAD－环巴胺（KAAD－cyclopamine）特异性阻断Hh信号，通过细胞划痕愈合实验以及Transwell小室检测肝癌细胞的迁移速率与侵袭能力，蛋白质印迹法检测E－钙黏蛋白（E－cad）在肝癌细胞中的表达差异。结果 Hh信号通路失活后，肝癌细胞迁移率由（41.3±7.0）μm／h显著下降至（24.9±3.8）μm／h（P＜0.01），运动及侵袭能力明显减弱，穿过Transwell小室和人工基底膜的肝癌细胞数量分别减少了（54.4±7.0）%和（48.3±11.9）%（P＜0.05）。随着Hh信号下调，E－cad在肝癌细胞中的表达量较前升高了2.32倍（P＜0.01）。结论 Hh信号通路与肝癌细胞侵袭力密切相关，KAAD－cyclopamine抑制Hh信号通路可导致SMMC－7721细胞E－cad的表达上调，抑制肝癌细胞侵袭力。

Hedgehog信号通路； 肝细胞癌； E－钙黏蛋白； 侵袭能力

手术治疗目前仍然是肝细胞癌最主要的治疗方式，遗憾的是大多数患者发病之初就已伴有广泛的侵袭和转移，从而失去手术机会，深入研究肝癌细胞的转移与侵袭显得尤为重要［1］。Hedgehog（Hh）信号转导通路是胚胎发育过程中具高度保守性的信号通路，其异常持续激活不仅会导致诸多恶性肿瘤的发生，而且与前列腺癌、基底细胞癌、胰腺癌等多种肿瘤的侵袭和复发相关［2］。本研究前期实验发现Hh信号在多种肝癌细胞系中均有不同程度的激活，而且在SMMC－7721细胞中，Hh信号的异常活性最为显著；同时，通过免疫组化检测，发现Hh信号与肝癌的分化程度及门脉转移密切相关［3－4］。然而，Hh信号通路与肝癌侵袭、转移之间的关系尚不清楚。因此，本实验以SMMC－7721肝癌细胞为研究对象，应用KAAD－环巴胺（KAAD－cyclopamine）特异性阻断肝癌细胞中的Hh信号途径，通过观测肝癌细胞的运动、侵袭和转移能力的改变，并检测E－钙黏蛋白（E－cad）表达水平的差异，进一步探讨Hh信号通路在肝细胞癌侵袭和转移中的作用及机制，以期为抑制肝细胞癌的转移提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

肝癌细胞系SMMC－7721保存于华中科技大学同济医学院附属同济医院中心实验室；KAAD－cyclopamine购自美国Sigma公司；高糖DMEM、双抗（青霉素、链霉素）和胎牛血清购于Gibco公司；Transwell小室系统购于美国Costar公司，Matrigel胶购于美国BD公司；兔抗人E－cad多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞划痕愈合实验

SMMC－7721肝癌细胞接种于6孔板中，密度为1×105／mL，常规培养，每48h更换培养液。当细胞形成单层的融合状时，使用枪头在细胞培养板底部进行等宽划痕，清洗去除刮落的细胞。以KAAD－cyclopamine 10μmol／L干预细胞，对照组以DMSO代替KAAD－cyclopamine，定时在倒置显微镜下测量划痕边缘距离，以划痕边缘距离／时间计算出细胞迁移速率。实验均重复3次，以平均值得出各组肝癌细胞的迁移速度。

1.3 检测细胞侵袭力

［4］方法构建Boyden Chamber侵袭小室，融解的Matrigel置入Transwell侵袭小室的上室，覆盖所有微孔。SMMC－7721肝癌细胞悬液按照实验分组，以1×105／mL的密度培养于各孔中，胎牛血清浓度为0.5%，同时，下室以10倍的胎牛血清作为趋化因子。培养24h后，聚碳酸醋膜固定后进行染色，随机计算视野中穿过膜的细胞数，实验重复3次，取其平均数。

1.4 检测细胞运动能力

Transwell小室中不添加Matrigel，其余步骤基本同上，计算穿过聚碳酸醋膜的细胞数，重复实验3次计算平均值，从而检测肝癌细胞的体外运动能力。

1.5 蛋白质印迹法检测E－cad蛋白表达

各组肝癌细胞用蛋白裂解液在冰上裂解细胞30min，收集细胞裂解液，4℃、12 000r／min，离心15min取上清液测定总蛋白含量，以电泳分离后将蛋白转移至纤维膜上，0.5%的脱脂奶粉封闭，兔抗人E－cad抗体4℃过夜，羊抗兔二抗再孵育1h，最后经ECL化学发光，曝光洗片，重复实验3次计算平均值。

1.6 统计学分析

应用SPSS 11.0软件进行相关统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间均数比较采用成组设计资料t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 划痕愈合实验

对照组SMMC－7721肝癌细胞在划痕24h后划痕基本融合，而KAAD－cyclopamine干预组的肝癌细胞愈合能力弱，45%的面积未愈合（图1）。肝癌细胞中Hh信号通路被阻断后，细胞的迁徙率由（41.3±7.0）μm／h下降至（24.9±3.8）μm／h（t＝6.55，P＝0.001）。

2.2 细胞运动与侵袭能力改变

SMMC－7721肝癌细胞具有较高的运动力，穿过Transwell小室细胞平均数为（102.8±8.7），而KAAD－cyclopamine阻断Hh信号通路后，仅（46.2±4.4）个细胞穿过小室（t＝11.01，P＝0.003）。同时，干预组肝癌细胞穿过Matrigel的数量为（36.1 ±6.4），也明显低于对照组（71.1±11.5）（t＝4.37，P＝0.02）（图2）。SMMC－7721细胞的运动能力和侵袭力均被KAAD－cyclopamine显著抑制，其中运动能力降低了（54.4±7.0）%，而侵袭力亦降低了（48.3±11.9）%。

图2 SMMC－7721肝癌细胞侵袭实验（×400）Fig.2 Invasion assay results of SMMC－7721cells（×400）

2.3 蛋白质印迹法检测E－cad蛋白表达改变

在SMMC－7721细胞中，E－cad蛋白表达量很低，仅为（0.19±0.08），当Hh信号通路被KAAD－cyclopamine阻断后，该蛋白的表达量显著升高至（0.45±0.25）（t＝6.98，P＝0.02），较前升高了2.32倍（图3）。

图3 阻断Hh信号对E－cad蛋白表达的影响Fig.3 Effects of blockage of Hedgehog signaling on the expression of E－cad

3 讨论

Hedgehog（Hh）信号通路是一条高度保守的信号转导通路，在胚胎发育、组织分化、细胞增殖、干细胞维持等调控过程中发挥重要作用。目前已证实，Hh信号通路的异常激活，可以导致细胞的过度增殖，促进了多种恶性肿瘤的发生发展［2］。近来发现，异常的Hh信号通路参与调节了细胞迁移、血管新生、上皮－间质转化等过程，该信号的异常活性被证实与胰腺癌［5］、口腔癌［6］、前列腺癌［7］、软骨肉瘤［8］等肿瘤的侵袭与转移息息相关。然而，在肝癌细胞的侵袭转移过程中，尚不清楚Hh信号通路是否参与其中。

本研究的前期工作发现，Hh信号通路活性在原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）组织中异常增高，且其异常活性在伴有门静脉转移的肝癌组织中更为明显［3］；同时，在分化程度低，具有较强的运动侵袭力的SMMC－7721肝细胞癌细胞中，Hh信号也出现了异常高表达［4］，这提示Hh信号异常可能与肝癌细胞侵袭、转移之间存在相关性。为了验证Hh信号通路在肝细胞癌细胞运动、侵袭力中的作用，本研究以SMMC－7721肝细胞癌细胞作为研究对象，应用KAAD－cyclopamine特异性阻断Hh信号，检测细胞运动、迁移和侵袭力的改变情况。当SMMC－7721肝细胞癌细胞中Hh信号被特异性阻断后，细胞划痕愈合力下降了近一半，而细胞的迁徙能力亦明显减弱，穿过Transwell小室聚碳酯膜细胞的数量显著减少，同时，穿越人工基底膜Matrigel的SMMC－7721肝细胞癌细胞的数量也随着Hh信号通路的阻断，而急剧减少，提示Hh信号对肝癌细胞运动和侵袭发挥易化、促进作用。由此我们推测，Hh信号通路与肝癌细胞浸润、转移等恶性行为密切相关，可能是肝细胞癌恶性行为发生的重要原因之一。

上皮－间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）以上皮细胞表型的缺失及间质特性的获得为主要特征，研究表明，EMT在肿瘤转移、侵袭过程中发挥极其重要的作用［9－10］。E－钙粘蛋白（E－cad）是上皮细胞的标志物，在调节细胞连接粘附中发挥核心作用，在EMT过程中E－cad表达减弱，被认为是肿瘤侵袭关键的抑制基因［11］。在肺癌、前列腺癌中，Hh信号异常激活后，E－cad表达下调可诱导肿瘤转移［12］，应用Cyclopamine阻断Hh信号后，促进E－cad的表达，同时抑制肿瘤的EMT进程［13］。EMT与肝细胞癌的侵袭转移也密切关联，当肝细胞癌变时，E－cad表达明显降低甚至不表达［14］；E－cad的表达程度与肝癌细胞的运动侵袭力具有显著相关性［15］，肝细胞癌分化程度越低，E－cad的表达阳性率越低，两者呈正相关。本研究为了进一步探讨Hh信号对肝细胞癌侵袭能力的调控作用机制，检测了E－cad的蛋白表达情况。SMMC－7721肝细胞癌细胞中E－cad的表达量非常低，应用KAAD－cyclopamine特异性抑制了Hh信号后，E－cad的表达量明显上调，提示在肝细胞癌的进展过程中Hh信号通路与EMT之间存在关联性，Hh信号的异常激活下调了肝癌细胞中E－cad的表达，参与了肝细胞癌的EMT过程，可能是维持SMMC－7721肝癌细胞的高侵袭力和运动力的重要因素。

综上所述，Hh信号在维持SMMC－7721肝癌细胞的运动与侵袭能力中发挥了重要的作用，其作用机制可能是通过抑制E－cad蛋白表达，参与肝癌细胞EMT过程来实现的。KAAD－cyclopamine作为Hh通路的特异性阻断剂，能很好地发挥抑制细胞侵袭、迁徙和转移作用，有望为治疗肝细胞癌复发转移提供新的途径。

参 考 文 献

［1］ 李星，陈展洪，魏丽，等.不同分期系统对晚期肝癌预后预测价值的分析［J］.中华肿瘤防治杂志，2013，20（7）:485－488.

［2］ Choudhry Z，Rikani A A，Choudhry A M，et al.Sonic hedgehog signalling pathway:a complex network［J］.Ann Neurosci，2014，21（1）:28－31.

［3］ 成薇婷，胡作为，田德英.Hedgehog信号通路与Snail在肝癌细胞系中的表达与意义［J］.华中科技大学学报:医学版，2010，39（2）:212－215.

［4］ 成薇婷，田德英.原发性肝细胞癌组织Shh和Ptch1与Gli2表达及生物学意义的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2009，16（3）:200－203.

［5］ Palmer C J，Galan－Caridad J M，Weisberg S P，et al.Z－fx facil－itates tumorigenesis caused by activation of the hedgehog pathway［J］.Cancer Res，2014，74（20）:5914－5924.

［6］ Fan H X，Wang S，Zhao H，et al.Sonic hedgehog signaling may promote invasion and metastasis of oral squamous cell carcinoma by activating MMP－9and E－cadherin expression［J］.Med Oncol，2013，31（7）:41.

［7］ Putzke A P，Ventura A P，Bailey A M，et al.Metastatic progression of prostate cancer and e－cadherin regulation by zeb1 and SRC family kinases［J］.Am J Pathol，2011，179（1）:400－410.

［8］ Xiang W，Jiang T，Guo F，et，al.Hedgehog pathway inhibitor－4suppresses malignant properties of chondrosarcoma cells by disturbing tumor ciliogenesis［J］.Oncol Rep，2014，32（4）: 1622－1630.

［9］ Steinway S N，Zañudo J G，Ding W，et，al.Network modeling of TGF－βsignaling in hepatocellular carcinoma epithelial－tomesenchymal transition reveals joint sonic hedgehog and wnt pathway activation［J］.Cancer Res，2012，74（21）:5963－5977.

［10］ 邹勇，曾玉兰，JNK对TGF－β1诱导的人肺上皮－间质转分化的调控作用［J］.华中科技大学学报:医学版，2014，43（6）: 658－662.

［11］ Canel M，Serrels A，Frame M C，et al.E－cadherin－integrin crosstalk in cancer invasion and metastasis［J］.J Cell Sci，2013，126（Pt 2）:393－401.

［12］ Yue D，Li H，Che J，et al.Hedgehog／Gli promotes epithelialmesenchymal transition in lung squamous cell carcinomas［J］.J Exp Clin Cancer Res，2014，33:34.

［13］ Yamamichi F，Shigemura K，Behnsawy H M，et al.Sonic hedgehog and androgen signaling in tumor and stromal compartments drives epithelial－mesenchymal transition in prostate cancer［J］.Scand J Urol，2014，19（3）:1－10.

［14］ Arzumanyan A，Friedman T，Kotei E，et al.Epigenetic repression of E－cadherin expression by hepatitis B virus x antigen in liver cancer［J］.Oncogene，2012，31（5）:563－572.

［15］ Schneider M R，Hiltwein F，Grill J，et al.Evidence for a role of E－cadherin in suppressing liver carcinogenesis in mice and men［J］.Carcinogenesis，2014，35（8）:1855－1862.

（2014－12－20 收稿）

Hedgehog Signaling Pathway Regulates the Migration and Invasion of Hepatocarcinoma SMMC－7721 Cells via E－cad

Xu Kai1，Cheng Weiting2△1Department of Orthopedics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China
2Department of Oncology，Wuhan No.1Hospital，Wuhan 430022，China

ObjectiveTo explore the role of Hedgehog（Hh）signaling pathway in the migration and invasion of hepatocarcinoma SMMC－7721cells and its mechanism.Methods Hedgehog signaling pathway was specifically blocked by KAAD－cyclopamine.Wound healing assay and Transwell assay were employed to detect the migration rate and invasiveness of SMMC－7721 cells and Western blot to measure the expression of E－cad in these cells.Results After inhibition of Hedgehog signaling pathway，the migration rate of SMMC－7721cells was significantly decreased from（41.3±7.0）μm／h to（24.9±3.8）μm／h（P＜0.01），the migrating and invasive capacity of these cells was conspicuously reduced，and the number of HCCs crossing the Transwell and matrigel was reduced by（54.4±7.0）%and（48.3±11.9）%（P＜0.05），respectively.The expression of E－cad protein in SMMC－7721cells after blockage of Hedgehog signaling pathway was 2.32times higher than that before inhibition（P＜0.01）.Conclusion Hh signaling pathway is closely related to the invasiveness of hepatocarcinoma cells.KAAD－cyclopamine may suppress the invasiveness of hepatocarcinoma cells by inhibiting the Hh signaling pathway and up－regulating the expression of E－cad.

Hedgehog signaling pathway； hepatocellular carcinoma； E－cad； invasiveness

R735.7

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.004

＊国家自然科学基金资助项目（No.81202121）；武汉市卫生局科研项目（No.WX12C07）

许 凯，男，1979年生，主治医师，医学博士，E－mail:godocoto＠163.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:joycvt＠163.com