Ki－67阴性结直肠癌细胞的增殖和自我更新能力的研究＊

颜 畅， 胡艺冰， 穆 磊， 黄开禹， 覃吉超△

Ki－67阴性结直肠癌细胞的增殖和自我更新能力的研究＊

颜 畅1， 胡艺冰2， 穆 磊1， 黄开禹1， 覃吉超1△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1分子医学中心2甲乳外科，武汉 430030

目的 观察结直肠癌中Ki－67阴性（Ki－67－／low）细胞在肿瘤增殖及自我更新（self－renew）中的作用，探讨将Ki－67－／low作为分离肿瘤干细胞标记物的应用。方法 通过将人结直肠癌标本消化成为单细胞，感染Ki－67启动子驱动GFP表达（pKi－67－GFP）的慢病毒后，注射至NOD／SCID小鼠背部建立pKi－67－GFP结直肠癌移植瘤模型；用流式细胞仪从移植瘤内分离出GFP＋EpCAM＋细胞（Ki－67＋癌上皮细胞）和GFP－／lowEpCAM＋细胞（Ki－67－／low癌上皮细胞），并采用免疫印迹验证Ki－67的表达；用流式细胞仪检测Ki－67－／low的细胞周期；采用PKH26标记细胞后，根据滞留细胞分析其在体内的增殖能力；采用荧光定量PCR（qPCR）研究Ki－67细胞中CD133、CD44和Lgr5等肿瘤干细胞相关基因的表达水平，并用成球实验研究Ki－67－／low结直肠癌细胞的自我更新能力。结果 从新鲜人结直肠癌移植瘤中分离出GFP＋EpCAM＋细胞和GFP－／lowEpCAM＋细胞，Western blot检测显示GFP＋EpCAM＋细胞高表达Ki－67，GFP－／lowEpCAM＋细胞不表达Ki－67；细胞周期检测显示，（82.25±3.16）%的Ki－67－／low细胞在G0／G1期，（51.67±4.11）%的Ki－67＋细胞在G0／G1期，体内PKH26标记滞留实验显示Ki－67－／low和Ki－67＋细胞分别含（81.53±5.85）%和（4.57±1.05）%PKH26阳性细胞，差异有统计学意义（P＜0.01），提示Ki－67－／low细胞主要是G0／G1期细胞，在体内处于慢增殖状态；荧光定量PCR证明Ki－67－／low细胞CD133、CD44和Lgr5的mRNA水平为Ki－67＋细胞的（3.47±0.79）、（6.18±1.65）和（4.67±1.15）倍，差异有统计学意义（P＜0.05），体外成球实验，Ki－67－／low及Ki－67＋细胞的成球数量分别为（83.00±9.54）和（8.00±2.66）（P＜0.01），提示Ki－67－／low细胞高表达CD133、CD44和Lgr5等肿瘤干细胞相关标记物，并具有显著的自我更新能力，富集肿瘤干细胞。结论 Ki－67阴性的结直肠癌细胞具有慢增殖的特点，较Ki－67阳性结直肠癌细胞具有更强的成球能力，在结直肠癌的自我更新中起重要作用，并有可能作为肿瘤干细胞的标记物。

Ki－67； 结直肠癌； 慢增殖； 自我更新； 肿瘤干细胞

近年来肿瘤干细胞假说得到重视，假说认为肿瘤中有一群具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的细胞，即仅肿瘤干细胞具备致瘤能力，而其他细胞无致瘤能力［1］。目前在结直肠癌中富集肿瘤干细胞的方法，主要为通过CD133、CD44和Lgr5等表面分子富集，但是准确来说肿瘤干细胞是个功能学的定义，并且基于此类蛋白表达的分选本身尚有不足之处，如不同肿瘤的标记物并不统一，细胞亚群间存在交集，此类标记物在功能上并不十分清楚［2］。

肿瘤干细胞除自我更新及分化等功能外，也具有耐药、慢增殖等特性［3－4］。针对其慢增殖的特性，我们通过将Ki－67启动子驱动的绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）序列转染至细胞内，通过流式分选出GFP－／lowEpCAM＋细胞，即Ki－67－／low结直肠癌细胞，研究其增殖及自我更新能力。

本研究首先观察实体瘤内Ki－67－／low细胞在体内具有慢增殖及自我更新能力的特点，探讨根据肿瘤干细胞慢增殖的特点，以Ki－67－／low作为一种通用标记物富集肿瘤干细胞的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

结直肠癌手术标本取自华中科技大学同济医学院附属同济医院胃肠外科2013年2月收治的分期为Duke C的女性结直肠癌患者。术前均未进行放、化疗，术后病理诊断为腺癌。实验动物为非肥胖性糖尿病联合免疫缺陷（non－obese diabetic／severe combined immunodeficiency，NOD／SCID）小鼠，雌性，4周龄，体重18～20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，置于华中科技大学同济医学院实验动物学部SPF级动物中心饲养。干细胞培养液为DMEM／F12培养液（美国Gibco公司）添加人表皮生长因子（EGF，10ng／mL，美国Sigma公司）、B27（美国Gibco公司）和基础成纤维细胞生长因子（bFGF，10ng／mL，美国Sigma公司）；APC标记的上皮特异性黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体（EpCAM－APC）及其同型对照（德国MiltenyiBiotec公司）；小鼠抗人Ki－67一抗（美国BD公司）；小鼠抗人内参甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗（美国CST公司）；PKH26－PE试剂盒、海地美溴铵聚凝胺溶液和碘化丙啶溶液（美国Sigma公司）；pKi－67－GFP慢病毒由上海生博生物医药科技有限公司提供；PCR引物由本实验室设计，武汉擎科生物有限公司合成:GAPDH（Forward Primer 5′－TCGTGGAAGGACTCATGACC－3′，Reverse Primer 5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′），CD133（Forward Primer 5′－GCCACCGCTCTAGATACTGC－3′，Reverse Primer 5′－TGTTGTGATGGGCTTGTCAT－3′），CD44（Forward Primer 5′－AGCAACCAAGAGGCAAGAAA－3′，Reverse Primer 5′－GTGTGGTTGAAATGGTGCTG－3′），Lgr5（Forward Primer 5′－CTCCCAGGTCTGGTGTGTTG－3′，Reverse Primer 5′－GAGGTCTAGGTAGGAGGTGAAG－3′）；流式细胞仪BD FACS AriaⅡ（美国BD公司）。

1.2 pKi－67－GFP移植瘤模型建立

取新鲜结直肠癌手术标本，用含Ⅳ型胶原酶（200～250U／mL）及透明质酸酶（20μg／mL）的消化液（DMEM／F12培养液）在37℃温箱内消化1h，每15min吹打1次；尼龙筛网（40μm）过滤，红细胞裂解后制得单细胞悬液，培养于含10%FBS DMEM培养液内，并加入海地美溴铵聚凝胺溶液至终浓度为10μg／mL，用感染复数（multiplicity of infection，MOI）为25的病毒量感染细胞72h后，将106个细胞注射于NOD／SCID小鼠背部。

1.3 流式检测及分选

以上述消化酶将人结直肠癌移植瘤消化为单细胞悬液。设立实验组和对照组，实验组按照每1× 107的细胞量加入EpCAM－APC 10μL，同时设同型对照组，4℃避光孵育15min，用PBS溶液洗3次后上机检测。流式分选的目标细胞群体为GFP＋Ep－CAM＋细胞和GFP－／lowEpCAM＋细胞。

1.4 Western blot检测

用NP40溶液裂解细胞获得总蛋白样品，行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），PVDF膜转膜并以脱脂牛奶封闭非特异性结合，然后依次孵育一抗及抗小鼠二抗后ECL显色液显色。

1.5 PKH26标记滞留细胞实验

从移植瘤内分离出单细胞后，以2×107／mL重悬在溶液C内。在1mL C溶液内加入4μL PHK26染料，迅速与细胞悬液混匀，室温下孵育5 min后以2mL血清中和，以PBS溶液洗3次后，注射106细胞于NOD／SCID小鼠背部，3周后取出肿瘤，流式细胞术分析GFP＋EpCAM＋细胞和GFP－／lowEpCAM＋细胞内PKH26＋细胞的比例。

1.6 成球实验

将1 000个细胞以2mL干细胞培养液重悬后，接种在超低吸附6孔板内，培养2周后，观测细胞的体外成球数目及大小。

1.7 荧光定量PCR（qPCR）

Ki－67＋和Ki－67－／low细胞用Trizol一步法提取RNA后，经逆转录合成cDNA，根据上述设计的CD133、CD44、Lgr5和GAPDH的引物，以荧光染料掺入法（SYBR green）进行PCR扩增，ABI7300检测各细胞亚群中CD133、CD44、Lgr5和GAPDH的Ct值，根据公式计算目的基因表达量。计算方式:改变的倍数（Fold Change）＝2－ΔΔCt，ΔΔCt＝（Ki67－／low细胞中目的基因Ct值－实验组GAPDH的Ct值）－（Ki67＋细胞目的基因Ct值－对照组GAPDH的Ct值）。

1.8 统计学方法

应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，实验数据用表示，采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人结直肠癌pKi－67－GFP移植瘤流式细胞仪分选GFP－／lowEpCAM＋细胞和鉴定

从新鲜移植瘤内用流式细胞仪分出高纯度的GFP＋EpCAM＋细胞和GFP－／lowEpCAM＋细胞（图1A），提取细胞蛋白，Western blot检测显示，GFP－／lowEpCAM＋不表达Ki－67蛋白，GFP＋Ep－CAM＋细胞高表达Ki－67蛋白（图1B），证明pKi－67－GFP慢病毒的感染有效，GFP－／lowEpCAM＋细胞为Ki－67－／low结直肠癌细胞。

图1 人结直肠癌移植瘤中Ki－67＋和Ki－67－／low细胞的分选和鉴定Fig.1 Separation and identification of Ki－67＋and Ki－67－／lowcells in xenografts derived from colorectal cancer tissues

2.2 流式细胞学、qPCR和体外成球实验结果

流式细胞仪检测分选细胞后，用碘化丙啶标记细胞，用流式细胞仪检测和Modifit软件分析细胞周期。Ki－67－／low细胞中G0／G1期、S期和G2／M期细胞的比例分别为（82.25±3.16）%、（13.59± 2.48）%和（4.15±0.71）%，Ki－67＋细胞中G0／G1期、S期和G2／M期细胞的比例分别为（51.67± 4.11）%、（42.65±3.53）%和（5.67±0.61）%（图2）。将来源移植瘤的细胞标记上PKH26后，再次注射入NOD／SCID小鼠背部，3周后收获肿瘤。流式细胞仪检测显示Ki－67－／low和Ki－67＋细胞中PKH26阳性细胞比例分别为（81.53±5.85）%和（4.57±1.05）%，差异有统计学意义（P＜0.01），提示肿瘤中Ki－67－／low细胞大部分处于G0／G1期，并在体内增殖缓慢（图3）。qPCR显示，Ki－67－／low中CD133、CD44和Lgr5mRNA的表达量分别是Ki－67＋细胞的（3.47±0.79），（6.18±1.65）和（4.67± 1.15）倍，差异有统计学意义（均P＜0.05）（图4），提示Ki－67－／low较Ki－67＋表达更高水平的CD133、CD44和Lgr5等肿瘤干细胞相关蛋白；体外成球实验，Ki－67－／low及Ki－67＋细胞的成球数量分别为（83.00±9.54）和（8.00±2.66）个，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5），提示Ki－67－／low细胞较Ki－67＋细胞有更强的自我更新能力。

图2 流式细胞学检测显示Ki－67－／low细胞是慢周期的细胞Fig.2 FCM showing that Ki－67－／lowcells are slow cycling cells

图3 流式细胞学检测Ki－67－／low和Ki－67＋细胞中PKH26阳性细胞比例Fig.3 FCM analysis of the proportions of PKH26＋cells in Ki－67－／lowand Ki－67＋cells

图4 荧光定量PCR检测Ki－67－／low和Ki－67＋细胞中CD133、CD44和Lgr5mRNA的表达水平Fig.4 qPCR analysis of CD133，CD44and Lgr5mRNA levels in Ki－67－／lowand Ki－67＋cells

图5 体外成球实验检测Ki－67－／low和Ki－67＋细胞的自我更新能力（右侧为Ki－67－／low和Ki－67＋细胞形成的球体）Fig.5 Evaluation of self－renewal capacity of Ki－67－／lowand Ki－67＋cells by sphere formation assay（spheres formed by Ki－67－／lowand Ki－67＋cells are shown in the right panel）

3 讨论

人结直肠癌患者来源的移植瘤更接近肿瘤在体内的生长模式并能更真实地反映肿瘤的异质性［5］，我们通过建立pKi－67－GPF的结直肠癌移植瘤模型，首先研究了在结直肠癌中Ki－67－／low细胞的增殖和自我更新能力，结果显示，Ki－67－／low细胞为慢增殖细胞，具有显著的自我更新能力。根据肿瘤干细胞的特性及定义，Ki－67－／low可在结直肠癌中作为富集肿瘤干细胞的标记物。

Pece等［4］发现在乳腺癌中可通过PKH26标记细胞，因增殖缓慢而滞留的PKH26阳性细胞也被证实富集肿瘤干细胞。韩军平等［6］在结直肠癌的免疫组化检测中发现，Ki－67－／low细胞中CD44＋的细胞占67%，CD44－／low的细胞占33%。以上发现表明，在乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中，慢增殖的细胞具有肿瘤干细胞的特性。并且，肿瘤干细胞通常表达三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2（ABCG2），可以将化疗药物泵出细胞外，具有明显的耐药能力［7］，提示Ki－67－／low的细胞可能是肿瘤耐药和复发的重要原因。

本研究通过建立pKi－67－GFP人结直肠癌移植瘤的模型，可以分选出肿瘤内Ki－67－／low细胞，证实这群细胞具有慢增殖和明显的自我更新能力，并表达更高的CD133、CD44、Lgr5等常用于富集肿瘤干细胞的标记物，与肿瘤进展、耐药和复发密切相关。我们可以通过已建立的模型，分离出Ki－67－／low细胞，研究可以有效促进其分化或进入细胞周期的药物，降低其自我更新能力和耐药能力，便于化疗药物杀伤。同时，也可通过在质粒后加入自杀基因，诱导Ki－67－／low细胞死亡，从而提高预后。

［1］ Shackleton M，Quintana E，Fearon E R，et al.Heterogeneity in cancer:cancer stem cells versus clonal evolution［J］.Cell，2009，138（5）:822－829.

［2］ Visvader J E，Lindeman G J.Cancer stem cells:current status and evolving complexities［J］.Cell Stem Cell，2012，10（6）: 717－728.

［3］ Kreso A，O’Brien C A，van Galen P，et al.Variable clonal repopulation dynamics influence chemotherapy response in colorectal cancer［J］.Science，2013，339（6119）:543－548.

［4］ Pece S，Tosoni D，Confalonieri S，et al.Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content［J］.Cell，2010，140（1）:62－73.

［5］ Siolas D，Hannon G J.Patient－derived tumor xenografts:transforming clinical samples into mouse models［J］.Cancer Res，2013，73（17）:5315－5319.

［6］ 韩军平，刘斌，杨艳丽，等.结直肠癌CD44＋／Ki－67－癌干细胞特征及其与临床病理关系［J］.世界华人消化杂志，2011，19（34）:3483－3488.

［7］ 胡均，李健，刘文松，等.人胆囊癌GBC－SD细胞系中干细胞样SP细胞群的分离及其ABCG2的表达［J］.华中科技大学学报:医学版，2008，37（2）:200－203.

（2014－12－19 收稿）

Proliferation and Self－renewal Capacity of Ki－67－／lowColorectal Cancer Cells

Yan Chang1，Hu Yibing2，Mu Lei1et al
1Molecular Medicine Center，2Department of Thyroid and Breast Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

ObjectiveTo investigate the proliferation and self－renewal capacity of Ki－67－／lowcells in colorectal cancer，and preliminarily discuss its function as a cancer stem cell marker.Methods Tumor specimens were obtained from patients with colorectal cancer（CRC）and were digested to single cell suspension.Cells infected by Ki－67promoter－driven GFP（pKi－67－GFP）lentivirus were then implanted into the back of NOD／SCID mice to establish models of pKi－67－GFP xenograft tumors.GFP＋Ep－CAM＋cells（Ki－67＋cancer cells）and GFP－／lowEpCAM＋cells（Ki－67－／lowcancer cells）were purified by flow cytometry（FCM）and Ki－67levels were evaluated by Western blot.Cell－cycle analysis of Ki－67－／lowcancer cells was performed by FCM，and cell proliferationin vivo was analyzed by PKH26label retaining experiments.The mRNA levels of CD133，CD44and Lgr5that are related to cancer stem cells were measured by qPCR and self－renewal ability was evaluated by sphere formation assay.Results Western blot showed that the purified GFP＋EpCAM＋cells were positive for Ki－67，whereas GFP－／lowEpCAM＋cells negatively or lowly expressed Ki－67.Cell－cycle analysis revealed（82.25±3.16）%Ki－67－／lowcells at G0／G1phase and（51.67±4.11）%Ki－67＋cells at G0／G1phase.PKH26label retaining experiments in vivo showed that Ki－67－／lowcells contained（81.53±5.85）%PKH26＋cells while only（4.57±1.05）%Ki－67＋cells were positive for PHK26（P＜0.05），suggesting that Ki－67－／lowcells were much more quiescent in vivo.qPCR revealed that the mRNA levels of CD133，CD44and Lgr5in Ki－67－／lowcells were（3.47±0.79），（6.18±1.65）and（4.67±1.15）times that of those of Ki－67＋cells（P＜0.01）.Sphere formation assay revealed that Ki－67－／lowcould generate（83.00±9.54）spheres，whereas Ki－67＋cells could generate only（8.00±2.66）spheres（P＜0.01）.Conclusion Ki－67－／lowcolorectal cancer cells slowly proliferate and they have higher capacity of sphere formation and self－renewal than Ki－67＋cells，suggesting that Ki－67－／lowcan be functioned as a cancer stem cell marker.

Ki－67； colorectal cancer； slow cycling； self－renewal； cancer stem cells

R735.3

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.002

＊国家自然科学基金资助项目（No.81172065）

颜 畅，男，1989年生，博士研究生，E－mail:yanchangforever＠163.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:jcqin＠tjh.tjmu.edu.cn