羟基红花黄色素A提取工艺的探讨

邹宇 牛英才 周丽 樊丽 潘虹 马晓星 洪博 王晓丽 李文静

摘 要：目的 研究并分析羟基红花黄色素A提取工艺，对该工艺做进一步改善與优化，使其更好的应用于医疗事业方面。方法 为使菊科植物红花内的羟基红花黄色素A含量达到更好的药用指标，对羟基红花黄色素A提取工艺进行进一步探究。对于红花的提取温度、浸泡时间、提取的溶剂用量多采用正交方法和单因素方法进行探究考察。结果 对于羟基红花黄色素A的最佳提取方法是用20倍的水将红花浸泡，然后于12h和4h各提取一次，过滤成液体，并合并过滤。同时，羟基红花黄色素A的提取在高温下及其不稳定，不易提取，而在低温下稳定性良好，便于提取。结论 使用浸渍法对羟基红花黄色素A进行提取，操作简便易懂，合理方便，但要控制好温度与时间。

关键词：提取工艺 操作简单 羟基红花黄色素A

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2015）03（c）-0083-02

作为菊科植物的一种，红花不仅能够有效通络静脉、活血祛瘀，而且具有镇痛止痛的功效。因此，该植物在临床上多用于冠心病、心肌缺血、心绞痛以及脑梗死、糖尿病并发症、高血压、视网膜病变等疾病[1]。是如今全世界范围内研究和关注的热点植物。研究发现，红花中以黄酮醇类化合物为主要成分。而红花最有效部位以查尔酮类化合物为主。在该化合物中，羟基红花黄色素A为成分最多、排在首位的元素，该元素不仅具有显著的药理效应，而且为无明显毒副作用的单体。是现阶段最具有开发价值的新药之一[2]。常用的提取羟基红花黄色素A的手段有煎煮法、冷侵法、温浸法以及渗漉法四大手段，其中煎煮法最为常用也是较为有效的提取方法。但针对羟基红花黄色素A（HSYA）具有较强的水溶性和热稳定性差等特点，本研究采取浸渍法对羟基红花黄色素A的提取工艺作进一步研究分析，并采取高效液相色谱法（HPLC）测定提取羟基红花黄色素A的含量，具体如下[3]。

1 仪器与材料

1.1 使用仪器

本次研究选取北京科明雷德科技有限公司供应的沃世特Waters2996高效液相色谱仪，该仪器主机主要参数为：高精度四元梯度泵、沃世特二极管阵列检测器以及120位的沃世特自动进样器，外加沃世特Chemstation色谱管理软件。同时，选用瑞士梅特勒AG135型号的电子天平（精确度达十万分之一）[4-5]。

1.2 所需材料

本次提取所需材料主要为来自安国以岭中药饮片厂的菊科类植物红花，且该红花经检验鉴定为正品；同时，需要南开大学化工厂生产的大孔树脂（D-4020型）若干以及上海信帆生物科技有限公司代理的Pharmacia公司葡聚糖凝胶（Sephadex LH--20）；同时还需要南开大学高分子研究所研制的ZTC O型天然澄清剂和一定量的聚酰胺薄膜。羟基红花黄色素A的对照品自制，即通过向精密秤取的羟基红花黄色素A中加入25%的甲醇进而制成1mL各含0.13mg的混合液[6-7]。

2 方法与结果

2.1 羟基红花黄色素A含量的测定

2.1.1 色谱要求

色谱柱主要选用沃特世symmetry C18（250mm×4.6mm，5μm），其流动相则为甲醇/0.5%磷酸=40∶60；波长检测为280nm，流速1.0mL/min，进样量10uL以及柱温30℃[8]。

2.1.2 制备试取样溶液

首先，用天平秤20g红花，然后将其放入密闭容器；然后向密闭容器内加入400ml的蒸馏水置于室温下12h，于12h后抽滤、定容，定容刻度仍取400mL。最后精密量取已得到的滤液2mL并置于10mL的容量瓶内。并加入一定量的蒸馏水使其至定容的刻度，等待检测其含量。

2.1.3 线性关系考察

精密吸取上述已制得的HYSA的对照溶液2、4、6、8、10以及12μL，并将其注入沃世特2996高效液相色谱仪。观察并记录液相色谱仪的显示图谱，分别记录图形的峰面积以及由该峰面积对样品溶液的浓度进行线性回归，得到Y=160 421X-9240的线性方程，相关系数r=0.9998即表明，羟基红花黄色素A在0.026～0.157mg/mL间线性关系良好[9-10]。

2.1.4 精密度试验

对羟基红花黄色素A的精密度考察，主要通过重复精密吸取羟基红花黄色素A的对照品溶液6次，得到相应的峰面积，然后计算其精密度，RSD=0.96%，即精密度良好。

2.1.5 稳定性试验

该实验均通过选取供试品溶液，将其分别在0、2、4、6、8、10h五个时间点进行进样处理，得出峰面积，最终计算得出RSD=1.23%，表明稳定性良好[11]。

2.1.6 重现性试验

按照稳定性的测定方法，测定同一样品的6份供试品溶液，得出峰面积并计算其含量，得到其平均值为2.16%，RSD=1.68%。

2.1.7 加样回收率试验

加样回收率的测定主要是将从供试品取出的9个试样，依次分别加入2、3、4mL对照品溶液中，按上述供试品溶液的方法制备，同时进样，测定峰面积，最终计算其平均回收率为99.6%，RSD=1.62%。

2.2 羟基红花黄色素A提取工艺的确定

2.2.1 正交设计表

本次研究对于羟基红花黄色素A的提取采用浸渍法进行提取，浸渍搅拌速度20r每分钟，首先对影响浸渍法提取的相关因素进行优选分析，包括加水量、浸泡次数、浸提时间，分别用A、B、C表示。依据L9（34）正交表进行分析研究，每个影响因素的选择要≧3，具体见表1。

2.2.2 试验方法

依据上述正交设计表，制备提取物并将其分为9个实验小组，并在色谱条件下测定羟基红花黄色素A的质量分数及提取率，见表2。其中，提取率=提取液中HYSA的含量/药材中羟基红花黄色素A的含量×100%[12]。

2.3 结果

9组实验采用控制变量法进行，由表2及表3可知，采用浸渍法提取的最佳提取工艺的条件为A3、B2和C2。同时，可知加水量（A）对羟基红花黄色素A的提取有明显的影响，因此提取过程中要严格把关。而浸泡次数（B）、浸泡时间（C）两者对提取工艺的影响不大，这也是日常生活中为何提取时将红花多浸泡一次的原因。最后，我们也不难发现加20倍的水同时浸泡40min为最优提取方案。具体见表2。

2.4 羟基红花黄色素A的纯化研究

临床上常用大孔树脂对初步提取的羟基红花黄色素A进行纯化，本研究选取南开大学化工厂生产的D-4020型大孔树脂对羟基红花黄色素A进行提纯。这不仅由于大孔树脂对于羟基红花黄色素A的吸附率、解析率高，而且有极好的转移率。本研究主要通过静态吸附洗脱筛选→动态吸附量及吸附曲线考察→洗脱溶媒的选择→验证实验等4大流程对采用大孔树脂对羟基红花黄色素A进行提纯的可行性进行研究。具体见张静、陈红专、王海亮等所发表文献[13]。

3 讨论

药理研究表明，羟基红花黄色素A为水溶性物质，因此，在本次研究中将其溶媒选用蒸馏水，这样不仅经济实惠，而且有助于环境保护。而且无需考虑其他溶媒的因素。现阶段，对羟基红花黄色素A的提取有煎煮法、冷侵法、温浸法等手段。但由于羟基红花黄色素A的热稳定性差，因此本次研究不选用煎煮法，而选用浸渍法[14]。

由上述研究结果可知，影响浸渍法提取羟基红花黄色素A的因素有浸泡时间，浸泡水量以及浸泡次数。其中，以浸泡水量为较大的影响因素。由上述结果可知，在相同浸泡次数和浸泡时间情况下，在一定范围内，浸泡水量越多羟基红花黄色素A的提取率越高。而在加20倍的水同时浸泡40min的条件为最优提取方案，其提取率高达92.81%。远远高于其他条件下浸泡法的提取率。

对于羟基红花黄色素A含量的测定，本研究主要采用高效液相色谱法，该方法不仅克服了传统化学法不能定量考察的弊端；而且克服了分光光度法及薄层层析法只能测量药物中总黄色素、红色素含量的缺点，以及薄层层析法误差大等缺点。高效液相色谱法用于测量羟基红花黄色素A的含量便捷、高效、准确。值得临床推广应用[15]。

总之，由于羟基红花黄色素A具有良好的水溶性以及热稳定性差等特点，因此提取过程中应避免长时间高温处理，选用浸渍法提取工艺能很好控制温度，同时掌控好侵泡用水量及时间，能够达到很高的提取率。而对于它的提纯选用大孔树脂技术同样具有上述优点，能够很好保护羟基红花黄色素A，避免其被破坏，最终得到纯度极高的羟基红花黄色素A。

参考文献

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