红豆杉针叶中黄酮类化合物的提取与鉴定

汤晓 朱建华 童燕

摘 要： 利用超声辅助技术提取红豆杉针叶中的黄酮类化合物，并利用HPLC法进行定性定量分析。结果表明，当乙醇体积分数为65%，液料比为15∶1，提取时间为45 min时，总黄酮的提取率最高；红豆杉针叶中的黄酮类化合物以苷类为主，尤其是槲皮素苷类。

关键词： 红豆杉； 针叶； 黄酮类化合物； 超声辅助提取； HPLC

中图分类号： R 284.2 文献标志码： A 文章编号： 1671-2153（2015）06-0102-03

0 引 言

红豆杉是世界公认的天然珍稀抗癌植物，它的根、皮、枝、叶等部位中含有紫杉醇、紫杉烷类等化合物，具有良好的抗癌效果[1]，亦含有二萜类、黄酮类、挥发油等其他组分[2]。

紫杉醇等成分多存在于根皮中，但由于红豆杉生长缓慢，因此，如果只开发利用根皮易造成红豆杉资源匮乏。与根皮相比，针叶中的有效成分也较多，且可以不断生长，从而实现植物的循环利用。研究表明，黄酮类化合物具有多种生理活性[3]，而它们往往富集于叶片中，可帮助植物免受紫外线损害[4]，因此，如能从黄酮类的角度开发利用红豆杉针叶资源，则能达到保护与开发该植物的双重作用。本研究旨在提取红豆杉针叶中的黄酮类化合物，并对其进行鉴定，以期更好地开发利用红豆杉针叶资源。

1 材料与方法

1.1 植物材料

红豆杉取自宁波慈城妙山，采摘后的红豆杉针叶，经干燥后，粉碎处理（80目筛）。

1.2 仪器与试剂

752N型紫外-可见分光光度计，超声清洗器，数显恒温水浴锅，LC-20AT高效液相色谱仪。

芦丁、槲皮素-3-O-β-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-3-O-β-葡萄糖苷、槲皮素、金丝桃苷、芹菜素标准品为色谱纯（纯度>98%），乙腈、甲酸为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 总黄酮的超声提取工艺优化

称取干燥后的红豆杉针叶粉末10 g，分别加入一定体积分数的乙醇和一定液料比（体积质量比）的水溶液冷浸30 min，再利用超声辅助提取一定时间，提取温度为40℃，提取两次，合并提取液。依次优化乙醇体积分数、液料比及超声提取时间。

1.3.2 总黄酮的质量分数测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法进行测定，测定波长为510nm，以芦丁标准品作标准曲线[5]。

1.3.3 总黄酮的结构鉴定

最佳超声辅助提取工艺下的总黄酮提取液，经旋转蒸发仪50 ℃蒸发浓缩至干后，进行HPLC检测[6]。

色谱柱为C18（150 mm×6.0 mm， 5 μm）；流速为1.0 mL/min；波长为360 nm；柱温为30 ℃；进样体积为10 μL。流动相A为水/乙腈/甲酸（87/3/10），流动相B为乙腈；进样量20 μL。

采用梯度洗脱：0～45 min，3%～25%B相；46 min，30%B相；47 min，3%B相。

2 结果与分析

2.1 总黄酮提取的最佳乙醇体积分数

乙醇体积分数的单因素实验结果如图1所示。

由图1可以看出，当用体积分数为65%的乙醇水溶液超声提取红豆杉针叶中的总黄酮时，总黄酮的提取率最高。这表明，红豆杉针叶中的黄酮类化合物可能为中等极性。

2.2 总黄酮提取的最佳乙醇液料比

液料比的单因素实验结果如图2所示（此时乙醇体积分数为65%）。

由图2可以看出，当液料比为15∶1时，红豆杉针叶中的总黄酮提取率最高。这表明，此时红豆杉细胞内外的总黄酮质量分数可能已达到平衡，因此，继续增加液料比时，总黄酮提取率不再增加。

2.3 总黄酮提取的最佳提取时间

超声提取时间的单因素实验结果如图3所示（此时乙醇体积分数为65%，液料比为15∶1）。

由图3可以看出，当提取时间为45 min时，红豆杉针叶中的总黄酮提取率最高。这表明，此时红豆杉细胞内外的总黄酮质量分数可能已达到平衡，因此，继续增加提取时间，黄酮类化合物不再被浸出。

2.4 红豆杉针叶中黄酮类化合物的鉴定结果

利用体积分数为65%乙醇水溶液再次超声辅助提取红豆杉针叶中的总黄酮，液料比为15∶1，提取时间为45 min。提取液中的黄酮类化合物HPLC定性定量分析结果分别如图4及表1所示。

HPLC鉴定结果显示，红豆杉针叶中含有8种黄酮类化合物，其中以苷类为主（6种），尤其是槲皮素苷类（4种），而质量浓度最高的为山萘酚-3-O-β-葡萄糖苷。红豆杉针叶中测得的游离黄酮类化合物仅有槲皮素与芹菜素，且质量浓度较低。

3 结果与讨论

超声辅助提取作为一种现代技术，具有缩短提取时间、节约能源、节省溶剂用量、避免高温破坏提取物结构等多种优点，超声波辐射所产生的强烈空化应效应、机械振动、扰动效应可显著提高有效成分的提取率[7]。有学者利用超声波技术提取了红豆杉枝叶中的总黄酮，并进行了工艺优化[8]。但是，由于红豆杉品种的差异，以及枝叶与针叶中黄酮类化合物的种类差异等因素，本研究的超声提取最佳工艺条件并不同于他人的研究。此外，由于本研究的目的着重在于分析红豆杉针叶中所存在的黄酮类化合物种类及其含量，以期为后期开发利用该植物奠定基础，因此，并未对提取工艺做进一步的探讨（提取方法及工艺参数的深入优化）。

红豆杉针叶中的黄酮类化合物以苷类（尤其是槲皮素苷类）为主，这表明，如同其他植物[4]，红豆杉针叶亦需要槲皮素苷类等有效成分帮助其抵抗紫外线辐射等外界氧化因素。但是，红豆杉针叶中的游离黄酮类化合物并不多，推测针叶中的黄酮类化合物在其生物代谢途径中，游离的黄酮类可能结合了植物中的糖类，代谢成苷类，以便更好地发挥此类有效成分的抗氧化作用。

红豆杉针叶中含有多种黄酮苷类，开发利用针叶资源可起到保护红豆杉资源的作用。利用超声辅助提取法可有效提取红豆杉针叶中的黄酮类化合物，提取工艺条件的优化值得进一步研究探讨。

参考文献：

[1] 卫强，张国升，刘金旗，等. 红豆杉枝叶中化学成分及含量研究进展[J]. 广州化工，2014，42（6）：17-23.

[2] 曾慧英，谢建春，卢立晃，等. 南方红豆杉叶挥发性成分[J]. 精细化工，2011，28（11）：1112-1116.

[3] CONFORTI F，SOSA S，MARRELLI M，et al. The protective ability of mediterranean dietary plants against the oxidative damage：the role of radical oxygen species in inflammation and the polyphenol，flavonoid and sterol contents[J]. Food Chemistry，2009，112（3）：587-594.

[4] 汤晓，邱从平，贾娟，等. 加拿大一枝黄花黄酮成分的动态分析[J]. 浙江农业学报，2011，23（5）：961-966.

[5] 黄泽元，王海滨，刘志伟. 芝麻叶中总黄酮的最佳提取工艺研究[J]. 农业工程学报，2004，20（6）：201-204.

[6] 汤晓，倪翠阳，王丽英，等. 煮制时间与二次煮制对紫娟普洱茶抗氧化性的影响[J]. 食品工业科技，2015，36（8）：141-147.

[7] 张贵明，王继文，王文泽，等. 朝鲜产东北红豆杉树皮中多糖提取工艺的比较研究[J]. 中国现代中药，2008，10（6）：32-34.

[8] 卫强，张国升，刘金旗，等. 皖南地区红豆杉枝叶中总黄酮的超声波提取工艺研究[J]. 中国医院药学杂志，2014，34（11）：886-889.

Abstract： The flavonoids in needles of Taxus Mairei were extracted by ultrasonic assisted technology. HPLC was used for qualitative and quantitative analysis of these flavonoids. The results showed that when 65% ethanol was used for 45 min of extraction under 15：1 of liquid-solid ratio， the total flavonoids extraction rate was the highest. The major flavonoids in needles of Taxus Mairei were glycosides， especially quercetin glycosides.

Key words： Taxus Mairei； needles； flavonoids； ultrasonic assisted extraction； HPLC

（责任编辑：徐兴华）