海南竹柏扁枝病病原植原体的分子检测鉴定

杨静宇等

摘 要 提取采自海南万宁热带植物园中表现典型扁枝症状的竹柏植株总DNA，利用植原体16S rRNA基因通用引物对P1/P7和R16F2n/R16R2进行巢式PCR检测。结果表明：扩增到大小约1.2 kb的植原体特异片段，通过对扩增片段进行克隆、测序和序列比对分析，结果确定为植原体感染。系统进化分析结果表明，该植原体（GenBank登录号：KP027298）为australasiae植原体候选种相关株系，与australasiae植原体候选种（GenBank 登录号：Y10097）的同源性为99.4%。进一步虚拟RFLP分析，结果表明该植原体属于花生丛枝植原体组（16Sr II）的一个新亚组，与其相似性最高的是16Sr II-A亚组（相似系数为0.97）。为指导竹柏扁枝病的防治奠定理论依据。

关键词 竹柏；扁枝病；植原体；分子鉴定；16S rRNA

中图分类号 S432.1 文献标识码 A

Abstract In this paper， universal primers of P1/P7 and R16F2n/R16R2 for phytoplasmal 16S rRNA gene were used to detect phytoplasma by nested PCR respectively. The 1.2 kb DNA fragments were amplified from the total DNA of Podocarpus nagi（Thunb.）Zoll. et Mor ex Zoll with fasciation disease symptoms， which were collected from the Tropical Botanical Garden， Wanning， Hainan. Sequence analysis determined that the P. nagi with fasciation disease was caused by a phytoplasma（GenBank accession： KP027298）， which shared 99.4% similarity of the ‘Candidatus Phytoplasma australasiaereference strain（GenBank accession： Y10097）. Furthermore， virtual RFLP analysis showed that the phytoplasma belonged to to a new subgroup within the peanut witches-broom（16Sr II）group， the most similar was the reference pattern of the 16Sr group II， subgroup A（GenBank accession： L33765）， with a similarity coefficient of 0.97. The study is important for effective prevention of the disease.

Key words Podocarpus nagi；Fasciation；Phytoplasma；Molecular identification；16S rRNA

植原体是一种无细胞壁的植物病原细菌，被归类于细菌界（Bacteria）软壁菌门（Tenericutes）柔膜菌纲（Mollicutes）非固醇菌原体目（Acholeplasmatales）非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae）植原体暂定属[Candidatus（Ca.）genus Phytoplasma][1]。植原体中的G-C含量低，寄生于植物韧皮部筛管细胞中，通过破环植物体内激素的平衡，削弱氨基酸和碳水化合物的转运，抑制光合作用，加速衰老，诱导病害症状产生[2-5]，感病植株的典型症状有黄化、丛枝、簇生、花变叶、矮化、小叶等[6]，主要通过叶蝉、飞虱等昆虫媒介进行传播[6-7]。植原体是许多植物病害的重要病原，迄今为止，全世界已报道的植原体病害超过1 000多种，造成巨大的经济损失。由于植原体无法分离培养，所以，不能通过常规的微生物分类方法进行分类鉴定，但随着分子生物学技术的快速发展，利用PCR方法扩增植原体的保守序列16S rRNA，并通过序列比对和RFLP分析能有效的对植原体进行鉴定和分类[8]。

RFLP分析是通过一个基于16S rRNA基因进行植原体快速分类鉴定的在线工具-iPhyClassifier在线进行序列同源性分析。模拟实验室限制性内切酶消化和凝胶电泳并生成虚拟限制性片段长度多态性图像文件；能实现IRPCM植原体/螺原体工作小组建立的植原体候选种分类方法[8]和Wei等[9]提出的16Sr组和亚组的分类标准，根据计算整个序列的同源性分数和RFLP模型的相似系数，立即对植原体候选种的分配和植原体16Sr组分类地位的假定给出建议。iPhyClassifier将序列同源性分数97.5%作为划分植原体候选种的临界值，RFLP模型相似系数0.85、0.97分别作为划分植原体16Sr 组和亚组的临界值[9]。当提交的16S rRNA基因序列同源性分数小于97.5%时，建议该植原体可代表一个新的植原体候选种；大于或等于97.5%时，建议为某一植原体候选种的相关株系。RFLP模型的相似系数小于或等于0.85时，建议该植原体可代表新的植原体16Sr组；相似系数大于0.85但小于或等于0.97时，建议该植原体可代表新的植原体16Sr亚组或已有16Sr亚组的不同株系或变种[10]。根据已经报道的16S rRNA序列，RFLP分析可将植原体分为32个组，有效地提高了基于16S rRNA基因序列的植原体分类系统[11]。

竹柏[Podocarpus nagi（Thunb.）Zoll. et Mor ex Zoll]为罗汉松科竹柏属的一种常绿乔木，广泛分布于浙江、福建、江西、湖南、广东、广西、台湾、海南和四川等地。竹柏是中国南方优良的多用途经济树种，由于其枝叶常绿、树形美观，可用于庭园绿化；其树干纹理直、结构细、易加工、耐久用，可用作建筑、家具、器具及工艺用材；其种仁含油率为50%～55%，经加工后可作为优质食用油或工业用油[12]。近些年，在海南万宁热带植物园的竹柏树上大量发生一种病害，该病害表现为茎端分生组织扩大，侧向分支不能独立于主枝生长，长出的枝条呈扁平的带状或鸡冠状，严重影响了竹柏的正常生长。该种症状在仙人掌[13]、黄槐[14]、中华小苦荬[15]等植物上曾有报道，但在国内尚未见关于竹柏扁枝病病原的相关报道。

本研究以表现扁枝症状的竹柏植株为材料，提取植株总DNA后，利用PCR技术进行16S rRNA基因片段的扩增，并对扩增片段进行克隆、测序和序列比对分析，以确定是否为植原体感染；再通过进一步系统进化分析及RFLP分析，以明确该病原的分类地位。

1 材料与方法

1.1 材料

表现典型扁枝症状的竹柏植株和无症状的健康竹柏植株均采自海南万宁热带植物园。DNA Ladder Maker 2000、克隆载体pMD18-Tsimple vector、感受态E. coli Competent Cell DH5a菌株购自TaKaRa公司，2×Eco Taq Master Mix、琼脂糖凝胶、DNA 回收试剂盒及质粒回收试剂盒、氨苄青霉素和IPTG购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物总DNA的提取 分别取典型扁枝症状的竹柏植株和无症状的健康竹柏植株的幼茎韧皮部，使用 DNeasy plant mini kit（Qiagen Gmbh， Hilden， Germany）DNA提取试剂盒，根据试剂盒操作说明分别提取植株的总DNA，提取的总DNA放于-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 利用植原体16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增。以植物总DNA为模板，参照Deng等[16]和Schneider等[17]报道的引物P1/P7先进行直接PCR扩增（表1），其扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（温度从64～56 ℃，每2个循环退火温度降低2 ℃，再在54 ℃的退火温度下进行25个循环），72 ℃延伸110 s；最后72 ℃延伸4 min。将扩增产物稀释30倍后做为模板，根据Gundersen等[18]报道的引物R16F2n/R16R2再进行巢式PCR扩增（表1），其扩增条件为：最后退火温度改为56 ℃，延伸时间改为70 s，其余条件与直接PCR扩增相同。PCR体系均为25 μL，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，然后通过凝胶成像系统进行观察摄影并记录图片。以健康植株总DNA为阴性对照，无菌蒸馏水为空白对照。

1.2.3 PCR产物的纯化、克隆和测序 利用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒纯化回收PCR扩增产物，将目的产物连接到载体pMD18-T，然后转化到感受态细胞DH5α中，取白色菌落培养并提取质粒，利用菌落PCR反应筛选阳性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。为了尽量减少可能产生的测序误差，每个样品至少选择3个阳性克隆进行测序。

1.2.4 序列分析、系统进化分析和RFLP分析 先使用DNAMAN软件进行序列的比对和装配，再将序列提交到NCBI上进行BLAST比对，与GenBank中已有的序列进行同源性比较分析，并利用邻接法在MAGA5.0[19]中构建系统进化树。最后使用植原体在线分析软件iPhyClassifier进行虚拟的RFLP分析。

2 结果与分析

2.1 感病植株的症状表现

由图1可知，感病的竹柏植株表现为茎端分生组织扩大，侧向分枝不能独立于主枝生长，长出的枝条呈扁平的带状或鸡冠状。

2.2 PCR扩增结果

表现典型扁枝症状的竹柏植株和健康的竹柏植株均利用引物对P1/P7、R16F2n/R16R2进行巢式PCR，结果见图2，感病的竹柏植株中扩增出约1.2 kb的特异条带，与目标片段的大小相符，而作为阴性对照的健康植株和空白对照的无菌蒸馏水均未扩增出条带。表明表现典型扁枝症状的竹柏植株中存在植原体。

2.3 序列分析与系统进化树的构建

将扩增出的特异条带进行纯化、克隆和测序。结果显示，16S rRNA基因扩增片段均含有1 248个核苷酸（GenBank 登录号：KP027298），G+C含量为47.4%。在NCBI上进行BLAST比对后，结果表明，该植原体是australasiae植原体候选种相关株系，与australasiae植原体候选种（GenBank No.：Y10097）的同源性最高，为99.4%。利用MEGA5中的邻接法，将海南竹柏扁枝病的植原体与其他相关植原体代表株系进行进化树构建，由图3可知，竹柏扁枝病植原体与植原体 16S rⅡ组成员聚集在同一进化分支上， 并与 16S rⅡ组A亚组的花生丛枝植原体（L33765）聚为一簇。

2.4 RFLP分析

使用植原体在线分析软件iPhyClassifier对海南竹柏扁枝病植原体进行虚拟RFLP分析，分析结果表明，该植原体16S rRNA基因片段的限制性内切酶片段多态性分析模型不同于所有以前建立的16Sr组/亚组的参考模型。该植原体属于花生丛枝植原体组（16Sr II）的一个新亚组，与其相似性最高的是16Sr II-A亚组（GenBank登录号：L33765），相关系数是0.97。

3 讨论与结论

竹柏扁枝病的发生使得竹柏枝条呈扁平带状或鸡冠状，影响了其木材的形状和质量，降低了竹柏木材的经济价值，但受植原体感染而形成的扁平带状或鸡冠状枝条具有一定的观赏性，可通过利用植原体引起的独特性状使得竹柏更具观赏价值和经济价值。目前已有报道显示植原体能成为形成植株理想经济性状的重要诱导剂，如花卉产业中重要的观赏盆栽植物一品红[20]，植原体能诱导使其丛簇生长无分支，更具观赏价值，形成一品红最理想和重要的经济性状而被大量商业化种植。但人为嫁接植原体进行经济性状的诱导可能带来植原体的扩散，有关工作尚需进一步的研究。

本研究利用巢式PCR扩增、序列分析、同源性比较等分子生物学方法对竹柏扁枝病植原体进行了分子检测鉴定，确定了海南竹柏扁枝病是由植原体引起的，且该植原体是australasiae植原体候选种的相关株系。通过系统进化树分析显示该植原体与植原体16S rⅡ组成员聚集在同一进化分支上，属于花生丛枝植原体组（16Sr II）的一个新亚组，与16S rⅡ组A亚组（GenBank登录号：L33765）的花生丛枝植原体聚为一簇，相似性最高。

近年来，南方地区报道较多的16S rⅡ-A组植原体侵染病害有花生丛枝病[21]、猪屎豆丛枝病[22]、臭矢菜丛枝病[23]等， 而在木本植物海南竹柏上发现16S rⅡ-A组植原体是首次报道。有研究报道显示，花生丛枝病与猪屎豆、臭矢菜都有很近的亲缘关系，16S rRNA其基因序列的相似性均大于99.8%，且发生花生丛枝病危害和流行的地方也发现过猪屎豆、臭矢菜等豆科植物丛枝病的发生，可能是16S rⅡ-A组植原体侵染了不同寄主， 或者存在密切的遗传变异或系统进化关系[21]。花生丛枝植原体16S rⅡ-A组中的臭矢豆丛枝植原体与竹柏扁枝病植原体的亲缘关系也非常近，16S rRNA基因序列相似性达到99.2%，只有9个碱基存在差异。随着植原体分类发展的深入研究，结果发现仅依靠16S rRNA基因序列对植原体进行分类不能满足亚组及株系的划分，因此，仍需对海南竹柏扁枝植原体的tuf、secY、rp基因等核苷酸序列进行分析研究，更进一步的研究植原体亚组及株系之间的关系，以便为指导竹柏扁枝病的防治奠定更多理论依据。

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