Caco-2细胞单层模型的建立及其评估

孙旭，罗余萍

1.中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心、药物非临床安全评价研究北京市重点实验室，北京 100176；2.南昌大学医学院 临床药理研究所，江西 南昌 330006

Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞，是一种研究口服药物吸收特性的细胞模型，结构与生化特点类似于人类小肠上皮细胞[1]。细胞在生长到一定程度后能形成微绒毛，并能分泌出小肠刷状缘上皮特异的碱性磷酸酶[2-4]。Caco-2细胞在体外的培养已广泛应用于新药开发、药物肠吸收机制的研究等[5]。目前，国内外关于Caco-2细胞单层模型的评估方法有很多，比如跨膜电阻(Teer值)的大小，甘露醇或荧光黄透过性试验及碱性磷酸酶活性等[6]。本实验通过对Caco-2细胞在Transwell板中跨膜电阻的检测及Transwell小室内外碱性磷酸酶活性的检测，对Caco-2细胞单层模型的建立进行了评估。

1 材料

1.1 细胞来源 购自美国典型菌种保藏中心( American Type Cμlture Collection，ATCC)，实验细胞均在30～40代范围内。

1.2 主要试剂 DMEM高糖含双抗培养基：北京索莱宝公司；二甲基亚砜(Dimethyl sμlfoxide，DMSO)：美国Amresco公司；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)：全式金公司；PBS Buffer缓冲液：江西南昌长城生物科技有限公司；0.25%胰酶-EDTA：Sigma公司；碱性磷酸酶试剂盒：南京建成生物有限公司。

1.3 主要仪器 Milli-Q Gradient A10 超纯水器：美国Millpore公司；CKX-41型倒置光学显微镜：日本Olympus；EVOM细胞电位仪：美国WPI；YXQ.SG41.280.B高压灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司；二氧化碳培养箱(Heraeus Heracell 150)：德国贺利氏；T-25培养瓶、24孔Transwell培养板(膜面积为0.33)：美国Corning公司；超净台：苏州净化设备厂；血细胞计数板：玉环县五金光学仪器厂；低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂。

2 方法及结果

2.1 细胞培养条件 所用培养基为DMEM高糖含双抗培养基(1%非必须氨基酸、1%L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10%胎牛血清)，接种于T-25培养曲颈瓶中，环境条件：培养箱37℃， 5%CO2，相对湿度90%。接种后24～48h内更换培养液，洗去死细胞残渣。之后2天换液一次，当细胞融合约达80%左右，用37℃预热的0.25%胰蛋白酶-1mMEDTA消化液进行消化，以1:3进行传代。

2.2 细胞复苏 将一支标记为2009年Caco-2细胞冻存管从液氮中取出，迅速放入已升为恒温37℃的水浴锅中，并不断晃动(尽量不要让水浴锅中的水碰到冻存管管盖)，使管里的细胞尽快溶解，溶解后拿于细胞房。将细胞用移液管移到已有5ml含10%胎牛血清培养基的离心管中，1000rpm离心5min，倒弃上清，往沉淀中加入2ml新鲜培养基，混匀后移到25cm2的培养瓶中，补加培养瓶中的培养基到5ml，混匀。放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。

2.3 Caco-2细胞跨上皮细胞电阻(Teer)的检测

2.3.1 制备单个细胞悬液 取对数生长期细胞，PBS洗2次后加入1.2ml胰蛋白酶消化3～5min，加入含10%胎牛血清的培养液终止消化，吹打管吹打使细胞完全脱壁，移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，倒弃上清，加入5ml新鲜完全培养基，混匀。

2.3.2 细胞计数 100μl单个细胞悬液+900μl培养基，混匀，滴入计数板上盖玻片的边缘，由于虹吸作用，液滴可均匀进入盖玻片底下的网格。

由此：离心管中的细胞密度为6×105/ml。

2.3.3 细胞接种Transwell板 将上述细胞密度调整到6×104/ml后接种于Transwell24孔板中，Transwell滤膜的顶侧(apical side，AP)加入细胞悬液100μl，基地侧(basolateral side，BL)加入无细胞培养基600μl。

2.3.4 Transwell板跨膜电阻(Teer)检测 电极处理：70%乙醇溶液浸泡15min，空气干燥15s，放入无菌PBS溶液中浸泡过夜。

Teer值是反映细胞单层完整性的一个指标，一般Teer值在200Ω·cm2～1000Ω·cm2范围之内，值越大便认为细胞单层致密完整。培养在Transwell板中的细胞，隔天换液，一个星期后每天换液。选取种板后的第2、5、7、10、15、20、22、25天分别检测电阻值。首先吸弃培养液，小室内外均加入预热的PBS溶液，重复三次，其中第三次放于培养箱中孵育30min后连上细胞电位仪测电阻。

跨膜电阻(Teer)值=(样品孔电阻-空白孔电阻)×膜面积

24孔板的膜面积为0.33cm2。结果分析：经测定，corning公司的Transwell 24孔板的空白电阻为100Ω左右，此次细胞培养前10天，细胞增殖缓慢，直到种板后的第10天，Teer值仍然在54Ω·cm2，与文献报道不是很一致，可能原因是细胞接种密度比文献低，至20天时Teer值达到500Ω·cm2，说明此时细胞已形成了完整的致密单层，之后，Teer值增到627Ω·cm2后保持不变(见图1，表1)。

2.4 Caco-2细胞极性考察 碱性磷酸酯酶是小肠上皮刷状缘标志性酶，在Caco-2细胞单层形成过程中可以分化出此酶。通过测定Caco-2细胞单层各阶段的碱性磷酸酯酶(Alkaline Phosphatase)活性可反映Caco-2细胞的生化特性以及细胞极性。本实验使用AKP试剂盒按说明书步骤分别在Caco-2细胞接种第3、15、22天从Transwell膜的两侧取样，测定不同时间段的碱性磷酸酶活力。

AKP试剂盒标准曲线见图2。

碱性磷酸酶活性(U/100ml)=样品酚浓度×100ml/0.05ml

结果分析：本实验接种到Transwell 24 孔板第3天的磷酸酶活性非常低，AP/BL为1.19。到了第15天小室内的磷酸酶活性明显比小室外高，AP/BL达到3.62。而接种后的第22天，磷酸酶活性进一步升高，AP/BL达到5.42。与第三天相比，第22天的磷酸酶活性增高了5倍多，为第15天时的2倍。由此可见，碱性磷酸酶的分布非常不对称，出现了明显的极化现象(见表2)。

图1 Caco-2细胞单层模型跨膜电阻值Fig-1 Transepithelial electrical resistances value of Caco-2 cell monolayers

图2 AKP标准曲线Fig-2 Standard curve of AKP

3 讨论

药物代谢特性研究是药物研发成功与否的重要因素之一。以往传统的体内药代吸收筛选模型，由于所需药物量大、难以批量化、耗时长以及费用高等弊端，已经无法满足现代新药的研发要求，快速、准确以及需药量少的药物吸收筛选模型已成为新药研发的重要方法。目前，被广泛采用的三种筛选方法是：大鼠原位单次灌注法、大鼠外翻肠囊法以及体外人结肠腺癌(Caco-2)细胞系法。其中，Caco-2细胞模型已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。从80年代起，Caco-2细胞体外培养模型就广泛用于模拟小肠环境进行口服药物吸收情况的体外筛选，以及口服药物吸收机制的研究[7]。对于Caco-2细胞单层模型完整性的评估，国内外均有大量报道。本实验结合国内外文献中方法，所用细胞代数为30-40代，细胞生长状态良好，增殖迅速。可用于细胞单层模型的建立。

表1 Caco-2细胞单层模型电阻和跨膜电阻值Tab-1 Resistance and transepithelial electrical resistances value of Caco-2 cell monolayers

跨膜电阻(Teer值)是检测Caco-2细胞单层模型完整性的指标之一，单层模型越完整，所形成的跨膜电阻越大。一般认为，＞200Ω·cm2时，细胞单层模型就已形成，Teer值继续增大，单层模型越致密[8]。本次实验中，细胞接种到Transwell板后的第7天，跨膜电阻就已达到209.75Ω·cm2，第10天后，几乎成线性上升，直到第22天到达一个稳定值627Ω·cm2。细胞形成了非常致密的单层。

碱性磷酸酶是小肠上皮刷状缘细胞的标志性酶，在细胞接种到Transwell板中后，可通过不同时间分别检测Transwell板顶侧(AP)和基底侧(BL)的碱性磷酸酶活性，对细胞分泌的磷酸酶进行定位。试验结果表明细胞生长的第3天，磷酸酶活性非常低，第15天时磷酸酶活性比较高。到了第22天时，磷酸酶活性进一步增加，AP/BL为第15天时的2倍。说明细胞可以产生极化。

表2 碱性磷酸酶活性与培养时间的关系(n=4, Mean±SD)Tab-2 The relationship between alkaline phosphatase activity and the length of time in culture(n=4, Mean±SD)

[1]陈健龙, 张玉玲, 董宇, 等.小檗碱在Caco-2 细胞单层模型中吸收和外排机制的研究[J].中成药, 2014, 36(4): 863-869.

[2]Ng SP, Wong KY, Zhang L, et al.Evaluation of the first-pass glucuronidation of selected flavones in gut by Caco-2 monolayer model[J].J Pharm Pharm Sci, 2004, 8(1): 1-9.

[3]Ghaffarian R, Muro S.Models and methods to evaluate transport of drμg delivery systems across cellμlar barriers[J].J Vis Exp, 2013,(80): 1-21.

[4]郭慧玲, 胡律江, 胡志方, 等.Caco-2细胞模型在中药成分吸收机制研究中的应用[J].江西中医药大学学报, 2014, 26(2): 64-66.

[5]Simmons AL, Chitchumroonchokchai C, Vodovotz Y.Isoflavone retention during processing, bioaccessibility, and transport by Caco-2 cells: effects of source and amount of fat in a soy soft pretzel[J].J Agric Food Chem, 2012, 60(49): 12196-12203.

[6]曾宝, 王春玲, 吴安国, 等.Caco-2细胞模型的建立及其在中药吸收研究中的应用探讨[J].中药新药与临床药理, 2010, 21(6): 570-573.

[7]Lee SD, Osei-Twum JA, Wasan KM.Dose-Dependent Targeted Suppression of P-glycoprotein Expression and Function in Caco-2 Cells[J].Mol Pharm, 2013, 10(6): 2323-2330.

[8]郭文峰, 胡灿, 温鹏, 等.人参皂苷Rg1对Caco-2细胞PepT1转运功能的影响[J].广州中医药大学学报, 2011, 28(4): 388-392.