高效液相色谱仪对甲硝唑注射液灭菌工艺筛选研究

李凤霞 王凤儒 李宏伟

①黑龙江中医药大学附属第一医院药剂科 黑龙江 哈尔滨 150040

②哈尔滨三联药业股份有限公司 黑龙江 哈尔滨 150025

注射剂系指药物与适宜的溶剂或分散介质制成的供注入人体内的溶液、乳状液或混悬液及供临用前配制或稀释成溶液。甲硝唑注射液是甲硝唑加氯化钠适量使成等渗的灭菌水溶液，是我国药品中重要制剂之一，临床使用非常广泛[1-2]。新医药改革的逐渐落实，药品新版良好生产规范(good manufacturing practice，GMP)[3]与国际标准的接轨，根据欧盟风险决策树的要求，无菌注射剂产品应该使用终端灭菌法，首选风险安全级别最高的过度杀灭法(121 ℃，15 min)，如果药物不能耐受121 ℃的高温，则可以选择残存概率灭菌法(115 ℃，30 min)，对于温度敏感的制剂可选择无菌生产工艺[4-5]。

甲硝唑注射液是硝基咪唑的衍生物，是一类广谱抗生素[6-7]。甲硝唑注射液在人体中通过还原生成具有代谢物抗厌氧菌作用，抑制细菌的脱氧核糖核酸的合成，从而干扰细菌的生长、繁殖，最终致细菌死亡[8-9]。甲硝唑制剂在临床上主要用于预防和治疗厌氧菌引起的感染，如敏感菌引起的呼吸道、消化道、腹腔及盆腔化脓性感染，皮肤软组织、骨关节等部位的感染以及脆弱拟杆菌引起的心内膜炎、败血症及脑膜炎等[10-12]。本研究以甲硝唑注射液中的活性成份甲硝唑的含量为检测指标，分析不同灭菌参数对甲硝唑含量的影响，从而筛选出适用于甲硝唑注射液的最优的灭菌工艺参数。

1 材料及方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪；甲硝唑标准品(中国药品生物制品检定所，批号：100191-200305；CAS 443-48-1)；甲硝唑注射液(规格250 ml:500 mg；国内A药厂；批号：130401、130402、130403；130401-1、130402-1、130403-1；130401-2、130402-2、130403-2)；流动相：水(双蒸水)，甲醇(80:20)，其他试剂级别为色谱纯。

1.2 对照品溶液的制备

精密量取甲硝唑标准品1.0 mg，加流动相溶解，并精密配制成0.25 mg/ml的标准品溶液。

1.3 样品的制备方法

分别称取甲硝唑适量，配置成浓度为0.5%药液为灭菌前药液，批号为130401、130402、130403备用；取1/3灭菌前药液经过度杀灭，可得药液，批号为130401-1、130402-1、130403-1备用；取1/3灭菌前药液经残存概率灭菌法，可得药液，批号为130401-2、130402-2、130403-2备用。

(1)未灭菌药液的制备。称取甲硝唑50 g，加水至25 L搅拌20～25 min使完全溶解，经0.22 μm超滤膜过滤，灌装，可得药液批号为130401、130402、130403。

(2)过度杀灭药液的制备。选用未灭菌药液(批号130401、130402、130403)于121℃水浴灭菌15 min，对应批号为130401-1、130402-1、130403-1。

(3)残存概率灭菌法药液的制备。选用未灭菌药液(批号130401、130402、130403)于115 ℃水浴灭菌30 min，对应批号为130401-2、130402-2、130403-2。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：水，甲醇(80∶20)；流速为1.5 ml/min；检测波长λ=320 nm；进样体积为10 μL；保留时间为10 min。

2 结果

2.1 系统适应性与线性关系

(1)理论塔板数计算甲硝唑＞2000。

(2)将甲硝唑标准品溶液(0.25 mg/ml)逐渐稀释成浓度分别为21.90 μg/ml、43.80 μg/ml、87.63 μg/ml、175.25 μg/ml、350.50 μg/ml和701.00 μg/ml的溶液。每个浓度进样10 μl，在上述色谱条件下分析，以峰面积平均值对其相对应的浓度建立回归方程。以相应峰面积Y对其进样浓度X(μg/ml)进行线性回归，得线性方程为：Y=56.78X+997.02(r=0.9999)。线性关系为21.90～701.00 μg/ml范围内，良好。

2.2 溶液稳定性

精密量取甲硝唑对照品溶液(0.25 mg/ml)，在0 h和24 h分别进样，在上述色谱条件下分析，计算其峰面积相对标准偏差RSD为1.03%，甲硝唑注射液在24 h溶液稳定。

2.3 精密度

精密量取甲硝唑对照品溶液(0.25 mg/ml)，在上述色谱条件下，重复进样6次，计算其峰面积相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)(精密度)为1.00%，表明甲硝唑注射液精密度良好。

2.4 回收率

精密量取甲硝唑注射液浓度已测定样品3份，每份1 ml，分别向其中加入甲硝唑标准液(0.25 mg/ml)0.5 ml、1 ml和1.5 ml作供试品溶液。摇匀进样，每组3次，测定加样后溶液中甲硝唑浓度与加样前溶液中甲硝唑浓度，测得甲硝唑注射液中甲硝唑的加样回收率平均99.76%，RSD值为1.21%。

2.5 检测线与定量限

取甲硝唑标准品(0.25 mg/ml)适量，逐步稀释，S/N=10为定量限，S/N=3检测线，试验结果定量限为0.6 μg/ml，检测线为0.2 μg/ml。

2.6 甲硝唑含量测定

取灭菌前药液、过度杀灭药液及残存概率灭菌药液制备样品，按上述色谱条件测定，各平行重复测定2次，求其峰面积的平均值，并通过回归方程计算样品甲硝唑注射液中甲硝唑含量。测定灭菌前药液甲硝唑含量分别为101.2%、102.0%及101.5%，采用过度杀菌法灭菌之后药液含量分别为101.0%、101.9%、101.5%，测定采用残存概率法灭菌后甲硝唑含量分别为101.3%、102.0%、101.5%(见表1)。

表1 甲硝唑样品含量测定试验结果

3 讨论

根据欧洲药典和“CPMP指南备注”的规定，无菌产品应在灌装到最终容器中之后进行终端灭菌。本研究对几种可供选择的灭菌条件进行优选，结合品种特性，以实际的研究结果证实灭菌工艺条件选择的合理性。只要条件允许，应首选过度杀灭灭菌工艺，因该工艺的无菌保证安全性高，对工艺全过程的控制要求相对较低，只要该药品是严格按照GMP的要求组织生产，即可确保无菌保证值达到≤10-6，而不必担心装载的生物负荷和耐热性。残存概率灭菌工艺则是从灭菌前微生物污染控制和灭菌过程控制两方面入手，使得灭菌F0值较低的情况下也能确保达到药典规定的无菌保证水平。但需注意到，某些产品在提高灭菌温度而缩短灭菌时间后，产生的杂质可能会有所降低，故要结合药物的具体情况，考察和评价所选灭菌程序对药物质量的实际影响[13-15]。

通过对甲硝唑注射液灭菌前3批药液含量、不同灭菌参数甲硝唑含量进行测定，按照上述经过验证的方法进行检测，发现3批灭菌药液标示量的含量变化不大。实验证明，甲硝唑注射液采用过度杀灭法、残存概率灭菌法灭菌后药液含量差别不大，表明甲硝唑注射液可以耐受终端过度灭菌法。按照欧盟风险决策树要求，为了保证注射剂产品的安全性，生产中应优先选择终端过渡灭菌法，并考虑灭菌耐受性，选择活性成分含量作为依据，本研究表明，高效液相测定法快速、准确，且操作方便。

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