RNA恒温扩增实时荧光检测技术检测支气管肺泡灌洗液对涂阴肺结核的快速诊断价值

范琳 王鹏 杨妍 马俊 葛燕萍 卫卫 崔振玲



·论著·

RNA恒温扩增实时荧光检测技术检测支气管肺泡灌洗液对涂阴肺结核的快速诊断价值

范琳 王鹏 杨妍 马俊 葛燕萍 卫卫 崔振玲

目的 研究结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时荧光检测技术(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)对涂阴肺结核的诊断价值。方法 对2012年6月至2014年6月收治的同济大学附属上海市肺科医院结核科的252例疑似肺结核患者进行筛查，痰涂片连续3次阴性者进入研究，行支气管镜检查，收集BALF，行结核分枝杆菌快速培养(Bactec MGIT 960)及SAT-TB检测，同时进行诊断。所有患者随访至少6个月，记录入选者的最后诊断、影像学特征、痰培养结果等所有相关信息。以培养法作为诊断的参考标准，计算SAT-TB诊断涂阴肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。 结果 共有234例涂阴疑似肺结核患者进入最后分析，其中58例培养阳性，112例为培养阴性经过临床诊断的肺结核患者，64例为非肺结核患者。以培养法为计算阳性标准，SAT-TB检测BALF诊断涂阴肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为81.0%(47/58，95%CI：69.0%～90.1%)、96.9%(62/64，95%CI：88.9%～100.0%)、95.9%(47/49，95%CI：86.4%～100.0%)及84.9%(62/73，95%CI：75.3%～92.2%)。SAT-TB的检测时间约2 h，快于培养法的31 d。结论 SAT-TB可通过检测BALF为涂阴肺结核患者提供快速、可靠的诊断依据，是一项有价值的诊断方法。

结核, 肺/诊断； 支气管肺泡灌洗液； 核酸扩增技术

结核病是危害人类健康的重大传染病之一，据最新全球结核病报告数据，2012年全球有860万例结核病新发及130万例死亡患者，死亡率在传染病中位居全球第二[1]。结核病的发现率在结核病控制中起着关键的作用。痰涂片及结核分枝杆菌培养仍然是确诊肺结核的传统方法，但痰涂片阳性率在我国总体不高，仅为10%～30%[2]，而培养法却需要6～8周。因此，临床上痰涂片阴性甚至无痰的肺结核疑似患者占到肺结核所有患者的绝大多数，传统方法因为阳性率低及耗时较长，已经不能满足临床对肺结核快速诊断的需求。近年来，多种结核分枝杆菌的快速诊断方法均已建立，主要是以DNA或者RNA作为检测靶标的分子生物学技术、噬菌体快速诊断法、基因芯片法等[3-5]。但是真正有效用于临床的只有Bactec MGIT 960快速培养法及以DNA扩增为基础的荧光探针定量PCR技术。前者可作为确诊的“金”标准，却仍然需要2～4周培养时间。对于后者，笔者曾经的临床研究发现痰荧光定量PCR法阳性率与痰涂片比较无明显的优越性，且有污染出现假阳性的可能，并不能取代痰涂片的传统地位[6]。

结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时检测技术(SAT-TB)是以结核分枝杆菌特异的16s rRNA为靶标，通过恒温RNA扩增技术，荧光标记的探针与靶标片段的扩增产物杂交后释放出荧光信号，对荧光信号进行实时检测，从而快速准确地判断待检样本中是否有结核分枝杆菌存在。笔者已有的研究发现SAT-TB对临床确诊的肺结核患者痰标本检出率为54%，高于罗氏培养法(42%)，而且整个操作只需要1.5～2 h，未发现假阳性现象，对于痰涂片阳性的标本，SAT-TB对肺结核的诊断敏感度可达97.6%[7-8]。但SAT-TB对于痰涂片阴性的疑似肺结核患者的快速诊断价值究竟如何尚缺少认识，且近年已经发表的SAT-TB临床研究检测标本集中在痰液[9-10]，对于检测支气管肺泡灌洗液(BALF)尚缺乏较大样本的数据支持。本研究将涂阴疑似肺结核患者收集BALF，进行SAT-TB的检测，评价SAT-TB通过检测BALF对涂阴肺结核的快速诊断价值。

对象和方法

一、研究对象

选取2012年6月至2014年6月期间收治入同济大学附属上海市肺科医院结核科的疑似肺结核患者252例。必须满足以下条件者作为研究对象：(1)发现肺部异常阴影，疑似肺结核患者；(2)痰涂片荧光抗酸染色连续3次阴性者；无痰患者行咽试子涂片3次阴性者；(3)取得患者知情同意，且知情签字同意行电子支气管镜检查者。入院后肺结核疑似患者痰涂片阳性者排除此项研究。临床试验注册号：0000-0002-9411-496X。

二、方法

1. 肺结核诊断标准：根据文献[11]和[12]。将涂阴疑似结核病患者分为3类：(1)确诊肺结核：指影像学具有疑似肺结核表现的患者具有呼吸道标本结核分枝杆菌培养阳性(简称“培阳”)；或者具有肺部病变标本病理学诊断证据；(2)临床诊断肺结核：不具备细菌学及病理学诊断证据，痰菌培养阴性(简称“培阴”)，但胸部影像学显示与活动性肺结核相符的病变，具有咳嗽、咯痰、咯血等症状，经过诊断性抗结核治疗随访病灶好转或能够排除其他肺部疾病者；(3)非肺结核患者：指诊断为肺结核以外的其他肺部疾病，且经过非结核病治疗好转者。

2. 临床检测方法：患者检测痰涂片、痰Bactec MGIT 960培养以及其他鉴别诊断需要的相关检测，所有研究对象行支气管镜检查，行支气管镜刷检涂片抗酸染色及支气管肺泡灌洗，收集BALF 5～10 ml。

3. BALF的SAT-TB法：BALF进行SAT-TB检测，使用SAT-TB试剂盒(上海仁度生物科技有限公司)进行操作，与痰液的标本前处理略有不同，BALF视清浊度不同，对于带有黏液的BALF标本可适量加入一些4%NaOH溶液进行液化，最多不超过样本量的1倍体积。同时行BALF的Bactec MGIT 960检测作为参照。

4. 同期收集患者临床资料：姓名、年龄、性别、诊断结果、胸部CT、血结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、血结核抗体、抗炎前后影像学资料的对照等结果，随访所有入选患者的治疗过程，随访至少6个月。

5. SAT-TB与临床现有诊断方法进行比较：比较BALF SAT-TB检测与支气管镜刷检涂片抗酸染色、BALF Bactec MGIT 960对涂阴肺结核的诊断价值。

6. 统计学分析：根据SPSS 18.0 统计软件进行分析，以BALF的Bactec MGIT 960培养结果作为阳性标准结果，计算诊断的敏感度、特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性似然比(LR+)、阴性似然比(LR-)，两组之间“率”的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、临床资料

共有疑似肺结核患者252例进入研究，其中17例入院后检查痰浓缩荧光抗酸染色阳性而退出该研究，入组检测患者235例，男155例，女80例。在随访中发现1例男性患者最终因诊断不明退出分析。进入最后分析的患者例数234例，其中肺结核患者170例，年龄(36.6±14.8)岁，非肺结核患者64例，年龄(45.2±16.4)岁。非肺结核的患者中肺炎37例(57.8%)，肺癌7例(10.9%)，支气管扩张5例(7.8%)，陈旧性结核伴细菌感染6例(9.4%)，肺部真菌感染4例(6.3%)，非结核分枝杆菌肺病2例(3.1%)，尘肺3例(4.7%)。诊断为肺结核的170例患者中，合并结核性胸膜炎5例，合并糖尿病8例，合并颈部淋巴结结核5例。经过支气管镜活检病理确诊者3例，具有病理确诊者的患者快速培养结果均为阳性。支气管镜刷检荧光抗酸染色阳性者2例，所有刷检涂片阳性的患者均得到培阳的结果。

最后经过BALF Bactec MGIT 960培养及结核科门诊随访，得到培阳的确诊肺结核患者58例，培阴、缺乏病理依据，但经过诊断性抗结核治疗门诊随访临床诊断为肺结核者112例，非肺结核患者64例。

二、以培养法为标准，BALF的SAT-TB诊断涂阴肺结核的价值

在确诊肺结核组中，SAT-TB阳性者47例，SAT-TB阴性者11例，而非肺结核组中，SAT-TB出现2例阳性，提示假阳性(表1)。以培养法阳性结果作为判断肺结核标准，非肺结核作为阴性标准，SAT-TB检测BALF诊断涂阴肺结核的敏感度为81.0%(95%CI：69.0%～90.1%)、特异度96.9%(95%CI：88.9%～100.0%)、阳性预测值95.9%(95%CI：86.4%～100.0%)、阴性预测值84.9%(95%CI：75.3%～92.2%)(表1，2)；SAT-TB对培阴肺结核的诊断效率见表2。

三、以临床诊断为标准，SAT-TB检测BALF诊断涂阴肺结核的价值

若以临床诊断作为判断肺结核的阳性标准，临床诊断肺结核包括培阳及培阴肺结核，非肺结核患者例数为阴性标准，SAT-TB诊断涂阴肺结核的敏感度40.0%(68/170，95%CI：33.0%～48.0%)、特异度96.9%(62/64，95%CI：89.0%～100.0%)、阳性预测值97.1%(68/70，95%CI：90.0%～100.0%)、阴性预测值37.8%(62/164，95%CI：30.0%～46.0%)。培养法在所有肺结核患者中的阳性率为34.1%(58/170)，SAT-TB的阳性率(40.0%，68/170)略高于培养法。有2例假阳性，考虑为污染的可能。

表1 SAT-TB检测BALF对涂阴肺结核的诊断结果

表2 SAT-TB检测BALF对培阳及培阴肺结核的诊断价值

注 “-”表示无意义；敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)

四、SAT-TB检测时间与培养法、支气管镜下活检、涂片法比较

在检测时间上，SAT-TB检测BALF的时间从操作气管镜取标本到实验室操作完成平均时间为0.5 d，Bactec MGIT 960培养法平均为(31±4.6) d，气管镜下活检病理检测时间为3 d，气管镜刷检检测时间为1 d，SAT-TB检测时间较培养法明显缩短，SAT-TB与快培法的诊断一致率较高，kappa值为0.80(表3)。

讨 论

一、SAT-TB的工作原理及检测优势

SAT-TB检测的靶标为结核分枝杆菌的16s rRNA，此检测技术的优点在于恒温42 ℃扩增、起始靶标及扩增产物都是RNA，RNA定量检测可直接反映检测标本活菌的存在与否。RNA在环境中容易降解，因此污染更少、扩增效率高(30 min内扩增10亿倍)、反应稳定。与痰涂片抗酸染色相比较，操作时间从1 d缩短到1.5～2 h；直接适时扩增标本中的RNA，可反映活菌的数量，而痰涂片无法鉴定细菌的死活，而SAT-TB对标本中含有非结核分枝杆菌者检测结果为阴性，优于涂片法，后者无法鉴别结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌。

表3 以临床诊断肺结核为标准对不同临床方法的诊断价值进行比较

注a：在170例肺结核患者中2例刷检阳性；b：在170例肺结核患者中3例活检阳性；敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)

二、BALF SAT-TB对涂阴肺结核的诊断效率评估

从该研究结果可看出，若以培阳作为计算肺结核的金标准，非肺结核为阴性标准，SAT-TB诊断涂阴肺结核的敏感度为81.0%，特异度为96.9%。将该技术与目前最新使用的其他分子生物学诊断方法进行比较，Xpert Mtb/RIF为最被认可的新型分子生物学诊断技术，该技术以待测标本的结核分枝杆菌 DNA的靶基因(rpoB)为检测目标，使用全自动PCR一体化检测方法，被WHO推荐使用，近期发表的研究报道Xpert Mtb/RIF诊断涂阴肺结核的敏感度为61%～81%不等[13-14]，Theron等[15]同样用BALF的Xpert Mtb/RIF诊断涂阴及无痰肺结核的敏感度为93%，特异度为96%，Le Palud等[16]用Xpert Mtb/RIF检测BALF对培阳标本的诊断敏感度为80%，特异度为98.6%；其他方法如Kim等[14]研究巢式PCR法诊断结核病的敏感度仅为69.4%，以IS6110为基础的环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[17]检测呼吸道标本诊断肺结核的敏感度可达89.6%，同一研究中的巢式PCR法和家庭式普通PCR法的诊断敏感度仅分别为79.2%和59.7%，特异度为100.0%。因此，与其他最新使用的分子生物学诊断技术比较，笔者用SAT-TB检测BALF诊断涂阴肺结核的敏感度与最新使用的其他分子生物学技术Xpert Mtb/RIF和LAMP相似，比经典的PCR法敏感度高。因此，SAT-TB检测BALF能提供较高的诊断敏感度及特异度。但是，从数据中不难发现，58例培阳标本中有11例SAT-TB阴性，说明产生了假阴性结果，与培养法比较SAT-TB的检出率为81.0%，而非100.0%，而21例培阴的肺结核患者标本中却被SAT-TB检出阳性。因此，若以临床诊断肺结核为计算肺结核阳性标准，SAT-TB对肺结核的检出率略高于培养法，但临床仍有约20%的培阳患者通过SAT-TB法无法检出。

此外，从检测时间上比较，SAT-TB的检测速度明显快于快培法，而检测结果与培养法的一致率达0.80，也就是说SAT-TB能够在最短的时间内提供准确率为80%的诊断结果； SAT-TB的检出率(40.0%)略高于培养法(34.1%)，因此，SAT-TB为一项快速、有价值的诊断工具。今后可扩大标本的检测范围到胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、淋巴结穿刺脓液等探索SAT-TB对肺外结核的诊断价值。

三、SAT-TB检测的缺点及可能产生的原因分析

分析不同的呼吸道标本检测，与笔者前期研究结果[18]比较，发现SAT-TB检测BALF对结核分枝杆菌的检出率低于痰液标本，笔者前期研究将SAT-TB检测涂阴肺结核的痰液标本的诊断敏感度和特异度分别为93%和98%，而理论上认为BALF的标本检出率应该高于痰液标本。究其原因，发现如下因素可能影响该项研究SAT-TB的检测效率：(1)标本取出后放置的时间过长。BALF的标本首先需要通过支气管镜，标本得到后对标本进行分装，部分标本需要送临床常规检测，笔者在课题实施过程中将BALF取出、分装等室温下经历的时间长达4 h以上，部分标本还经过冰箱冷冻集中送检，与痰液相比，室温放置的时间过长可能导致SAT-TB对标本中16s rRNA的检出率降低；(2)临床操作气管镜时对支气管冲洗的部位不够精确、BALF的量偏少，这些因素都可能导致对结核分枝杆菌的检出率降低；(3)尽管SAT-TB操作技术污染率低，笔者仍然发现了2例假阳性结果，因此分析在取BALF时容易通过内镜消毒不严、标本运送等操作环节造成标本污染；(4)此外，除了标本运送方面的原因，检测人员的操作环节仍有探索的空间，可能存在标本的前处理因素的干扰，因此BALF的标本处理方法可能需要改良。在该项技术的今后临床使用中，以上是值得关注的重要因素，若处理不当，则可能限制该技术在临床上的广泛应用，降低其实际诊断价值。

四、小结

SAT-TB检测BALF在涂阴培阳肺结核中的诊断敏感度达81.0%、特异度96.9%，检测时间仅2 h，在肺结核患者的BALF标本中SAT-TB对结核分枝杆菌的检出率(40.0%)略高于培养法(34.1%)，SAT-TB检测BALF是一项对涂阴肺结核患者快速、有价值的诊断方法之一。

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(本文编辑：郭萌)

Fast diagnostic value of SAT-TB for smear-negative pulmonary tuberuclosis using bronchoalveolar lavage fluid

FAN Lin, WANG Peng, YANG Yan, MA Jun, GE Yan-ping, WEI Wei, CUI Zhen-ling.

Clinic and Research Center of Tuberculosis, Shanghai Key of Tuberculosis, Shanghai Pulmonary Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200433, China

FAN Lin, Email: fanlinsj@163.com

Objective To study the diagnostic value of SAT-TB(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis) for smear-negative pulmonary tuberculosis(PTB) by testing bronchoalveolar lavage fluid (BLAF). Methods From June 2012 to June 2014 in Shanghai Pulmonary Hospital Tongji University, we screened 252 suspected PTB patients with 3 consecutive negative sputum smears, and obtained their BLAF specimen by brochchoscopy. BALF was tested by both Bactec MGIT 960 culture and SAT-TB assay. We diagnosed all patients, followed up for at least 6 months and collected associated information of patients regarding final diagnosis, culture results, imaging changes. The sensitivity, specificity, PPV and NPV for each diagnostic test were calculated using culture results as reference standard. Results Of 234 PTB suspects included in the final analysis, 58 were TB culture positive, 112 were PTB patients by clinical diagnosis with culture negative, 64 were non-TB patients. Using culture confirmed results as reference standard, the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value of SAT-TB for smear-negative PTB testing BALF were 81.0%(47/58, 95%CI：69.0%-90.1%), 96.9%(62/64，95%CI：88.9%-100.0%), 95.9% (47/49，95%CI：86.4%-100.0%) and 84.9%(62/73, 95%CI：75.3%-92.2%). The detection time of SAT-TB was around two hours, remarkably shorter than 31 days needed by culture. Conclusion SAT-TB can provide reliable, fast diagnostic evidence for smear- negative PTB and is a valuable diagnostic method.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Bronchoalveolar lavage fluid； Nucleic acid amplification sechniques

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.02.005

上海市卫生局科研课题计划任务(20124183)

200433 同济大学附属上海市肺科医院结核病临床诊疗中心 上海市结核病(肺)重点实验室

范琳，Email: fanlinsj@163.com

2014-10-18)