江西省急性髓系白血病NPM1和FLT3-ITD基因突变分析

简正伟 ，石淙 ，闻芳 ，万腊根 ，张长林

(1、南昌大学第四附属医院检验科，江西 南昌330003；2、南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌330006)

急性髓细胞白血病 (acute myeloid leukemia,AML)是多能干细胞发生突变所形成的一类具有细胞和分子遗传学特征的高度异质性疾病。随着分子生物学技术不断的应用于临床，越来越多的基因突变检测对临床的治疗起着重要提示作用。其中NPM1和FLT3-ITD基因是突变率最多见的两类，2010年美国血液学会 (American Society of hematology)会议已明确[1]，NPM1基因突变是AML,尤其是正常核型AML预后良好的指标,而具有FLT3-ITD基因突变患者预后较差。本研究分析187例初发急性髓细胞白血病患者NPM1和FLT3-ITD基因突变情况，并分析其临床特征。

1 材料与方法

1.1 临床病例 收集2011年6月至2013年2月南昌大学第一附属医院急性髓细胞白血病初发病例187例，所有患者都经细胞形态学和流式细胞术免疫学分型，并参照《血液病诊断及疗效标准》[2]确诊为AML的病例。其中M1占9例，M2占72例，M3占50例，M4占20例，M5占24例，M6占4例。男女比例100:87，中位年龄41(13～79)岁。

1.2 染色体分析 取肝素抗凝的骨髓液2ml，换算成有核细胞约(1～2)×106／ml，然后分别用直接法和短期培养法制备染色体，采用G显带技术进行核型分析。染色体核型描述参照《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2005)》。

1.3 NPM1和FLT3-ITD突变检测 取200μlEDTA抗凝骨髓，参照飞捷生物科技公司的微量基因组DNA极速抽提试剂盒提取基因组DNA，获得的基因组DNA通过紫外分光光度计进行定量，取50～100ng/μl基因组DNA进行基因突变检测。NPM1突变检测方法见参考文献[3]。以特异性引物扩展FLT3-ITD基因突变区,上游引物为5’gcaatttaggtatgaaagccagc-3’， 下游引物为 5’ctttcagattttgacggcaacc-3’,扩展产物经琼脂糖凝胶电泳分析，野生型FLT3扩展产物为329bp，存在ITD突变会在野生型条带上游出现特异性条带。

1.4 统计学分析 应用SPSS17.0统计学软件进行分析，以中位数进行统计，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 NPM1和FLT-ITD突变检测 采用等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)方法检测NPM1基因突变，该方法可以检测到4种常见的NPM1基因突变(图1)。采用PCR扩展FLT3基因第12外显子，通过观察PCR产物在琼脂糖凝胶电泳的迁移情况判断FLT3-ITD突变(图2)。在收集到的187初发急性髓系白血病患者中，共检查到67例(35.83%)患者存在基因突变，其中39例(20.68%)AML患者存在单一 NPM1突变，15例(8.02%)出现单一FLT3-ITD突变，13例(6.95%)患者同时存在NPM1和FLT3-ITD突变。

图1白血病病人NPM1突变检测

图2 FLT3-ITD突变检测

2.2 NPM1和FLT-ITD突变与FAB分型关系 见表1。

表1 白血病病人基因突变情况n(%)

2.3 临床资料特征 在187例患者中，有NPM1突变患者和非NPM1突变患者之间在男女比例、中位年龄、血小板中位数和骨髓原始细胞比例中位数均没有差异性，但是白细胞中位数二者有差异(表2)。在FLT3-ITD突变患者临床特征分析中，在男女比例、中位年龄、血小板中位数和非FLT3-ITD突变患者没有差异性，两者在白细胞中位数和骨髓原始细胞比例中位数有差异性，FLT3-ITD突变患者白细胞中位数和骨髓原始细胞比例中位数都比非FLT3-ITD突变患者高(表3)。

表2 NPM1突变患者临床特征分析

表3 FLT3-ITD突变患者临床特征分析

2.4 突变和细胞遗传学的关系 在187例白血病患者中，有72例患者没有检测染色体或者检测了未检见分裂相，在可分析的115例患者中，80例正常核型当中，有17例(21.3%)NPM1突变;在35例异常核型组中，检见13例NPM1突变；在正常核型中同时检测出11例FLT3-ITD突变，突变率为13.8%，而在异常核型组中，检出8例FLT3-ITD突变，突变率为22.9%，但两者之间均无统计学意义(表 4)。

表4 比较白血病病人NPM1和FLT3-ITD突变患者染色体情况

2.5突变型和野生型疗效的比较 187例患者治疗效果比较，其中NPM1突变型52例，野生型135例，2组之间≤2个治疗周期CR缓解率分别为79.5%和35.8%(P<0.05);FLT3-ITD突变患者28例，野生型159例，两者之间≤2个治疗周期CR缓解率分别为27.6%和72.8%(P<0.05);随访时间1~25.6月，中位随访周期9.6月。

此外，我们把187例患者分成NPM1+/FLT3-ITD-组、NPM1-/FLT3-ITD-组、NPM1+/FLT3-ITD+组和NPM1-/FLT3-ITD+组进行疗效观察，2个治疗周期CR缓解率分别为82.3%、65.8%、52.9%和26.8%。其中单独NPM1突变组完全缓解率最高，而单独FLT3-ITD突变组完全缓解率最低。

3 讨论

急性髓系白血病AML是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，具有高度的异质性。一直以来，我们都是通过检测白血病患者染色体的变异来区分病人的预后情况。但是对于一些染色体正常核型病人，我们不能很好地区分患者的预后情况。随着分子生物学技术不断地应用于临床，一些新型基因突变检测可以很好地对病人治疗、预后提供指导价值。在这些基因突变中，NPM1和FLT3-ITD是突变率最高，对预后评估最有价值的两类基因。

我们在187例初发白血病患者中分别检测出NPM1突变率为27.80%(52/187)；检测出FLT3-ITD突变率为14.97%(28/187)。 和日本学者Suzuki T(24.9%NPM1,22.6%FLT3-ITD)[4]；德国学者 Thiede C(27.5%NPM1,21%FLT3-ITD)[5]、泰国学者 Boonthimat C (26%NPM1,33%FLT3-ITD)[6]相比较，NPM1突变率基本接近，但是他们FLT3-ITD突变率都比我们的研究结果要高，可能是由于样本分布不同和种族差异有关。

在本研究中NPM1突变主要存在于M5、M2和M1中。丁子轩等[7]研究656例中国急性髓系白血病患者NPM1基因突变情况，其中有169例突变，突变率大约25.8%，其中以M5、M1多见。Jeon Y等[8]研究发现，在83例AML患者中有NPM1突变19例，突变率为22.9%，在形态学亚型中多见于M5和M2。这和我们的研究结果相近。但是我们研究FLT3-ITD突变多存在于M1、M4中较多见，而国外学者研究病例中FLT3-ITD突变多存在于M3[9]，这可能是病例样本组成不同或者国内外样本差异有关。

我们研究FLT3-ITD突变患者在年龄 、性别和血小板中位数之间差异没有统计学意义，但是突变阳性患者比阴性患者在白细胞中位数和骨髓原始细胞比例中位数均显著偏高，这和国外研究结果相一致[10]。这可能与FLT3-ITD突变引起近膜区空间构型改变引起RTK持续激活,导致细胞增殖有关[11]。而NPM1突变患者在年龄 、性别、血小板中位数和骨髓原始细胞比例中位数同阴性患者之间无显剧差异，但是突变阳性患者白细胞中位数较阴性患者偏高[12]。

国内外研究认为NPM1和FLT3-ITD突变在染色体正常核型多见[13]，但我们在187病例中只有115例可分析染色体核型，两者突变在正常核型和异常核型之间并没有差异性，这与国外研究结果不一致，可能是国内外病例组成不同；另外我们有72例患者没有检测出染色体，可能这部分病例有较多正常核型样本，所以对正异常核型比有一定影响。

一般研究认为NPM1基因突变是预后良好的指标，存在NPM1基因突变的患者缓解率高，生存期长，并且在疾病进展中比较稳定[14，15]。而FLT3-ITD突变意义则相反，一般预后较差。2008年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)和欧洲造血与血液病理学协会共同制定AML新的分型分类计划，认为NPM1基因突变的可以作为AML亚群中独立的预后指标[16]。我们把NPM1和FLT3-ITD突变阳性和阴性患者在2个治疗周期CR缓解率进行比较，发现NPM1阳性患者在2个治疗周期CR缓解率较阴性患者效果好，而FLT3-ITD突变阳性患者则CR缓解率效果差，两者之间差异均有统计学意义。同时我们按NPM1和FLT3-ITD突变阴阳性分成四组，发现单独NPM1突变组完全缓解率最高，而单独FLT3-ITD突变组完全缓解率最低，这与国内外研究结果相符[17]。

通过同时检测NPM1和FLT3-ITD突变情况，可以给临床白血病患者治疗、预后提供指导意义。

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