高温胁迫下受小热休克蛋白26(sHSP26)影响的玉米叶绿体蛋白质的研究

李娜娜，杨彦芳，赵飞云，胡秀丽

(河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002)

农作物在生长发育过程中常常会遭遇许多胁迫，而高温胁迫是其遭遇的最普遍的非生物胁迫，严重降低了农作物的产量［1］。因此，提高农作物的耐热性，使其在胁迫环境下保产并增产迫在眉睫。植物sHSPs是核基因编码的蛋白质，其大小为15～43 kD的不同蛋白质，正常条件下它参与细胞内蛋白质新生肽链的折叠、转运、成熟及变性蛋白质的降解，而在胁迫条件下主要维持蛋白质的可溶状态，使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构型，这些小热休克蛋白在提高植物耐热性方面发挥着重要作用［2－3］。最近的研究表明，通过转基因方法将sHSPs转入植物后能提高植物的抗性［4］。定位于叶绿体的sHSPs通常有3个高度保守区域，分别命名为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ区域，前2个区域存在于所有的小热休克蛋白中，而区域Ⅲ(富含甲硫氨酸)只存在于 CP-sHSPs中［5］。HARNDAHL 等［6］发现叶绿体sHSP内富含甲硫氨酸的а-螺旋区域被氧化成为亚砜后，直接导致叶绿体sHSP寡聚体构象的改变，随之其类似分子伴侣功能丢失，而当这些甲硫氨酸亚砜重新被还原后，叶绿体sHSP构象及类似分子伴侣功能恢复。说明叶绿体sHSP内这个特有的加Met保守区域对于结合底物蛋白非常关键。因此，在胁迫条件下，这种结构的变化可以保护植物免遭氧化胁迫［7－8］。HECKATHORN 等［9］在1998年证明了在番茄中叶绿体小分子热激蛋白能够在高温逆境下提升PSⅡ整个电子传递链的电子传递速度，并且在高温胁迫下对PSⅡ的保护作用发生很迅速。许多植物在氧化或高温胁迫下都有CP-sHSP26的表达，以保护PSⅡ的光化学活性免受氧化和高温胁迫的影响［4，7－8］。先前试验已证明，玉米幼苗在高温胁迫下可诱导sHSP26的高度表达［10］，但CP-sHSP26在高温胁迫下的功能机制仍不清楚。因此，本研究以玉米品种郑单958叶片为试验材料，运用双向电泳(2-DE)和质谱分析等技术，确定高温胁迫下与sHSP26相关的蛋白质及其与叶绿体之间的关系。为研究CP-sHSP26保护玉米抗高温胁迫的作用机制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以耐干旱［11］玉米品种郑单958为试验材料，采用水培方式培养。用质量分数为2%NaClO对玉米种子消毒10 min，蒸馏水冲洗数次后浸种8 h，然后在培养箱中28℃催芽1 d，随后选取萌发一致的种子种在盛有培养介质的周转箱中，并放在光照培养箱中培养。光照培养箱的温度控制在28℃/22 ℃(昼/夜)，光合有效辐射为400 μmol.m－2.s－1，相对湿度(75±5)%，光周期14 h/10 h(昼/夜)。当玉米幼苗的第2片叶完全展开后，对其进行高温胁迫，高温胁迫是将温度从28℃以2℃·h－1升高至42℃并维持1 h，共处理8 h，随后取下第2叶片用于叶绿体的制备。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 叶绿体的提取及完整度的检测 依据MUNNE-BOSCH等［11］方法提取叶绿体。随后使用荧光显微镜对叶绿体完整度进行检测。

1.2.2 叶绿体的处理 因为sHSP26是诱导型蛋白，由核基因控制在高温胁迫下表达，在此条件下我们分别用水、免疫球蛋白(IG)和AT-sHSP26处理纯化的叶绿体。其比为1∶3 000，孵育30 min之后，40℃ 热激 10 min，立即保存于 －80℃备用［11］。

1.2.3 叶绿体蛋白质提取及含量的测定 叶绿体蛋白的提取采取 WANG等［12］方法，采用 BRADFORD［13］法测定蛋白质的含量。

1.2.3 sHSP26 Western blot 分析 将含有 25 μg蛋白质样品在12.5%SDS-PAGE凝胶上电泳，电泳后将蛋白质转移到PVDF膜上，用抗玉米sHSP26多克隆抗体检测 ，免疫复合物用辣根过氧化物酶偶联的二抗(山羊抗兔)进行检测，印记使用3，3－二氨基联苯胺四盐酸盐显色［14］。试验至少重复3次。

1.2.4 2-DE 2-DE 采用 WANG 等［15］的方法。试验至少重复3次。

1.2.5 数据处理和图像分析 运用Excel 2003对所得数据进行处理。用软件Image Master 2D Platinum 6.0(GE Healthcare公司)对凝胶双向电泳图像进行分析处理，包括背景的消减、斑点的检测、匹配、分子质量和等电点计算，获取斑点位置坐标及蛋白质点量值的标准化分析等。

1.2.6 MALDI-TOF质谱分析 利用基质辅助激光解吸电离/飞行时间(MALDI/TOF)质谱分析待测定的双向电泳蛋白点。将胶中差异显著的蛋白点挖出，使用含500 ng胰蛋白酶的50 mmol· L－1碳酸氢铵(pH值8)在室温酶解过夜后，对所得肽段依次使用体积分数1%三氟乙酸(TFA)的水溶液、含体积分数50%乙腈的0.2%TFA水溶液抽提、冻干后，再用ZipTipTMC18把肽段洗涤干净，然后把肽段重新悬浮在10 μL的0.1%TFA水溶液中。Tip头先用50%乙腈洗涤3次后再水化、再用0.1%TFA水溶液洗涤3次后进行平衡，平衡后吸入肽段溶液10次以确保结合。包含肽段的tip头用0.1%TFA的水溶液洗涤3次，接着使用3 μL的50%乙腈/0.2%TFA水溶液把肽段洗脱下来。制备好的样品在质谱仪上采用反射模式分析的正离子谱测定，飞行管长2.7 m，离子源加速电压为20 kV，反射电压为23 kV，N2激光波长为377 nm，脉冲宽度为3 ns，离子延迟提取100 ns，质谱信号单次扫描累加50次，胰蛋白酶自切降解峰作为内部标准校正，获得肽质量指纹图谱(PMF)。

1.2.7 数据库查询和蛋白质信息分析 用Mascot Distiller软件(Matrixscience)对PMF图谱进行单同位素峰识别，用Mascot软件(Matrixscience，http://www.matrixscience.com)对获得的肽段质荷比 (m/z)数值进行检索。用SWISS-PROT数据库 (http://www.expasy.org/sprot/)和 NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行搜索分析，进而得到蛋白质的名称、相对分子质量(Mr)和等电点(pI)。在网站 http://workbench.sdsc.edu/中点击Click to Enter the Biology Workbench 3.2进入蛋白质工具(Protein tool)界面进行蛋白质理化性质等分析。

1.2.8 放氧速率的测定 应用 Chlorolab-2液相氧电极系统 (Hansatech，Norfolk，England)，在25 ℃含有 20 mmol· L－1NaHCO3的 50 mmol·L－1Tris-HCl buffer，pH 值7.5溶液中测定叶绿体的放氧速率，其光强为1 600 μmol·m－2·s－1［16］。试验至少重复3次。

2 结果与分析

2.1 AT-sHSP26处理效果检测

参照HECKATHORN等［9］方法用sHSP26抗体处理分离的叶绿体。为进一步检测AT-sHSP26是否转入玉米叶片叶绿体并发挥了作用，用免疫印迹技术分析了sHSP26的相对丰度，结果如图1－A、图1－B所示，经AT-sHSP26处理后，sHSP26相对含量明显降低。表明AT-sHSP26已成功转入叶绿体并影响了sHSP26的含量。

图1 玉米叶绿体蛋白sHSP26 western blot分析(A)及其相对强度分析(B)Fig.1 Western blot analysis of the sHSP26(A)and relative intensity(B)in maize chloroplast proteins

2.2 受sHSP26影响的叶绿体蛋白质的鉴定

为了证明sHSP26对叶绿体蛋白质的影响，提取叶绿体之后分别经免疫球蛋白和AT－sHSP26处理，进行高温处理后提取蛋白质进行双向电泳分离。经双向电泳图谱比较分析发现24个差异蛋白点(图3－A)，经鉴定后表明属于14个蛋白质(表1)，根据其功能(表1)归为6种类别:光反应(42%)、ATP 合成(29%)、卡尔文循环(17%)、染色质合成(4%)、胁迫蛋白(4%)和未知蛋白(4%)(图4)。与IG处理相比，用 sHSP26抗体(AT－sHSP26)处理后，与光合作用相关的蛋白质(ATP合酶 α，β和 γ亚基、放氧增强子蛋白(OEE1)、叶绿素a/b结合蛋白、细胞色素b6/f复合体铁硫亚基、光系统Ⅰ反应中心亚基Ⅳ4和铁硫中心蛋白)表达下调(图3－B)，说明高温胁迫下这些蛋白质受到了sHSP26的影响，同时证明了sHSP26保护了这些蛋白质免受高温的伤害，并在植物光合作用中扮演着至关重要的角色。

图3 受sHSP26影响的叶绿体蛋白的鉴定Fig.3 Identify of chloroplast proteins affected by sHSP26

表1 高温胁迫下受sHSP26影响的玉米叶绿体蛋白的鉴定Table 1 Identification of maize chloroplasts protein affected by sHSP26 under heat stress

续表Continuing table

2.4 sHSP26对叶绿体PSII中心放氧活性的影响

为了证明sHSP26对玉米叶绿体PSⅡ活性的影响，通过用sHSP26抗体(AT－sHSP26)和免疫球蛋白(IG)预处理玉米叶绿体后，再进行高温处理，对上述制备的叶绿体进行放氧测定作为反应叶绿体PSⅡ活性。结果显示，高温胁迫下其PSⅡ的放氧速率与IG处理相比明显下降(图5)。表明高温胁迫下 sHSP26保护了 PSⅡ的活性，暗示了sHSP26具有提高PSⅡ抗高温胁迫的能力。

图4 高温胁迫下已鉴定玉米叶绿体蛋白质的功能分类Fig.4 Functional classification of maize chloroplasts protein identified under heat stress

图5 玉米叶绿体的放氧速率Fig.5 The rate of O2evolution in maize chloroplasts

3 讨论

植物在生长发育过程中形成了许多调节机制来适应周围环境的胁迫，常常通过诱导和积累sHSPs达到增强抗性的目的［2］。目前对sHSPs的研究主要集中在不同胁迫条件诱导其表达，比如:干旱、高温、氨基酸类似物、金属、紫外线、ABA等［17－21］。在高等植物中，几乎所有胁迫都能诱导sHSPs的表达，这些对研究植物响应不同胁迫提供了新的依据。本实验组先前研究证明，高温胁迫下sHSP26在玉米叶片中大量表达，并参与热激反应［10］。在本研究中发现一些在高温胁迫下受sHSP26保护的蛋白质，并且这些蛋白质主要参与光合作用中光反应和卡尔文循环。光反应主要由4种蛋白复合体来传递:PSⅡ、细胞色素b6/f复合体、PSⅠ和ATP合酶复合体。在本研究中，存在17个蛋白质(点 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、18、19、21、22和24)参与光反应，其中4个蛋白质(点6、9、10 和12)属于 PSⅡ，3 个蛋白质(点 16、18 和21)属于细胞色素b6/f复合体，3个蛋白质(点19、22 和24)属于 PSⅠ，7 个蛋白质(点1、2、3、4、5、7和8)属于ATP合酶复合体，另外有4个蛋白质(点11、13、14和15)属于卡尔文循环。

在植物中，热损伤的主要指标之一是放氧复合体(OEC)和PSⅡ中的相关辅助因子及固碳作用中的Rubisco酶和ATP合成系统［22］。放氧复合体蛋白包括OEE、OEE1和OEE2，属于核编码的叶绿体蛋白，在响应高温胁迫时 OEE表达上调［23］。CP-sHSPs不但能够保护植物PSII和类囊体膜免受高温胁迫，而且能保护光合电子传递和 OEC［24～26］。在藜中1个22 kD的CP-sHSPs能特异性与PSⅡ中耐热OEC蛋白相互作用［27］，在高羊茅中，高温胁迫下CP-HSP26过表达，显著增加了PSⅡ(Fv/Fm)光化学活性［28］。在本研究中，AT-HSP26转化后OEE1(点6)表达下调(图3－B)，并且高温胁迫下PSⅡ的放氧速率显著降低(图5)。前人研究显示，在水稻和杨树中，高温胁迫显著增加了叶绿体ATP合酶CF1的α链［29］。细胞色素b6/f复合体是光合电子传递链中非常重要的组分，包含许多小亚基，在PSⅡ到PSⅠ电子传递过程中发挥着重要作用［30］。细胞色素b6/f复合体可能参与了热胁迫机制［31］。在本研究中，高温胁迫下细胞色素b6/f复合体的铁硫亚基表达增加，经AT-sHSP26处理后其表达量降低(点16、18和21)(图3－B)。果糖-1，6-二磷酸激酶(FBA)作为卡尔文循环中的1个酶，参与核酮糖-1，5-二磷酸(RuBP)的合成。高温胁迫增加FBA的表达或许可以维持CO2的累积效率［25］。本研究中，高温胁迫下FBA表达上调，用AT-sHSP26处理后，抑制FBA表达量的增加(图3-B)。高温胁迫增加了整个电子传递效率，Ab(met)和Ab(a)的加入，均降低了高温下电子传递速率［9］。同样在本研究中，用AT-sHSP26处理后光合反应速率明显降低(图5)，说明sHSP26保护了高温胁迫对PSⅡ的损伤。

本研究显示，sHSP26与玉米叶绿体蛋白质在高温胁迫下的相关性，sHSP26能够维持PSⅡ功能的稳定和能量的合成，使玉米叶片免受高温胁迫的损伤。本研究结果为揭示胁迫应答反应中蛋白互作提供了重要的依据，为进一步阐明sHSP26保护玉米叶绿体的功能及阐明光合作用机制提供了理论依据。

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