Twist2的生物学功能及其分子机制

赵承孝，杨泽

1.卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所医学遗传室，北京 100730；

2.北京协和医学院研究生院，北京 100730；

3.山西医科大学药学院，太原 030001

Twist2也称为Dermo1，于1995年经酵母双杂交系统筛选发现，是与真皮发育相关的细胞因子[1]。twist基因从水母到人类都是保守的[2]，2003年Šošić等[3]将种群间twist基因序列进行对比，按发现的时间顺序将twist和dermo-1分别命名为twist1和twist2。人twist1基因定位于7p21染色体上，twist2位于2q37.3[4]。

Twist2属于碱性螺旋–环–螺旋(Basic helix-loophelix protein, bHLH)家族B类成员。bHLH家族的转录因子调控多种细胞的分化，分为两类：A类广泛存在于机体组织和细胞类型，如 E12；B类在限定组织中表达，如肌源性的 MyoD、成神经细胞中的achaete。B类成员蛋白易与A类蛋白形成异源二聚体，结合在基因控制区的E-box共有序列(CANNTG)[5]，实现对目的基因的转录调控。

Twist2发挥转录因子的功能，调控作用的发挥受到时空表达、磷酸化、二聚化和细胞定位的调节。Twist2参与多条调控通路，在真皮发育、骨骼发育、肿瘤形成及肿瘤的侵袭与转移中都有重要的功能，因此研究Twist2在个体的正常发育、体内平衡和疾病中的作用显得尤为重要。

1 Twist2的生物学功能

twist基因在胚胎期即有表达，是胚胎发育的必须基因，在小鼠胚胎形成过程中，受精 13.5 d后Twist2表达增加，表达部位侧重在软骨膜和真皮[1]。Twist2在正常成人的分泌腺体组织和分泌小管中表达，如胃腺主细胞；同时在肝细胞、前列腺上皮、睾丸输精管、卵泡颗粒细胞、肾集合管和分泌管、子宫腺体、肾上腺皮质、肺小支气管和肺泡都有表达。Lee等[6]利用免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)在多种分化的成人组织中检测Twist2的表达，其主要在胞浆表达；相反，未分化的胚胎组织中，主要在核内表达，对细胞的调节不仅与表达水平高低有关，还与细胞中的定位密切相关。Twist2在调节增殖机制、磷酸酶活性、时序性表达方面都具有独特的作用。

Twist2的无义突变导致 Setleis综合征(Ⅲ型FFDDs，面部真皮发育不良)[7]。对Twist2的早期研究主要集中在骨骼发育方面，随后在多种肿瘤中发现其有表达差异，多项研究肯定了其与肿瘤发生、进展和预后的关系。近年研究表明，Twist2在肿瘤上皮–间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)中发挥重要作用。

1.1 Twist2对骨骼发育的影响

twist2 mRNA在成骨细胞的表达水平随着细胞分化的进程而变化，在分化初期表达增加，分化后期表达下降[8]。在成骨细胞系MC3T3的分化过程中，Twist2表达水平也下降，若将其表达增高，骨的标志性蛋白骨钙素(OC)和/或碱性磷酸酶(AP)出现相应的下降，成骨被抑制[9]。所以 Twist2能通过抑制成骨细胞的成熟，将细胞维持在前成骨细胞阶段，抑制骨的形成。在软骨板发育的早期，成软骨细胞和周围间质细胞都有Twist2表达，尤其在足趾尖端，表达部位特异的定位于细胞核，提示Twist2能发挥转录因子的作用[6]。

Osathanon等[10]证实Twist2对人牙周韧带间充质干细胞(Human periodontal ligament derived mesenchymal stem cells, HPDLs)成骨分化具有调节作用，用Notch的配基Jagged-1处理HPDLs，twist2的mRNA表达水平下降，同时Notch通路的目标基因hes-1、hey-1表达升高。Jagged-1通过Notch通路和Twist2的调控，增强了HPDLs的成骨分化。Notch信号通路在多种细胞类型的命运决定和分化中起重要作用。

twist亚家族中的两个成员twist1和twist2对骨骼的发育都有调节作用，但 twist2的无义突变导致Setleis综合征，twist1的显性突变造成Saethre-Chotzen颅骨早闭，提示两个基因在皮肤和骨骼发育中具有不同的功能[7]。为了研究Twist1和Twist2这两个蛋白调节骨发育的协同作用，将twist1和twist2分别敲除一个等位基因，获得单倍剂量不足的复合小鼠Twist1flox/+和 Twist2cre/+，分析 6～8 d小鼠的骨骼表型，结果并未出现骨化提前、颅缝早闭，有别于twist1单倍剂量不足造成的表型；但却出现骨形成减少、骨祖细胞的增殖分化受损[11]。twist2基因敲除小鼠表现出相对正常的胚胎发育，并无明显的骨发育异常，但在出生2～3 d后由于恶病质、促炎性细胞因子水平升高而死亡[12]。Twist2能抑制骨骼的发育，并存在与Twist1协同调节的作用。

1.2 Twist2在肿瘤中的作用

Twist2在大部分的人肿瘤中高表达，少数肿瘤出现表达降低。twist2 mRNA在黑色素瘤、肾癌、食管鳞状细胞癌的组织及对应细胞系都呈现高表达，在肺癌和慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia, CLL)未见表达。

据报道，Twist2在 93.9%(31/34)人乳腺癌和其全部淋巴结转移(8/8)中高表达，而在对应的大部分非肿瘤组织(8/12)不表达。在人乳腺表皮细胞(Human mammary epithelial cells, HMECs)和乳腺癌细胞，Twist2异位高表达导致了细胞形态学转化，增强了细胞的体外克隆形成能力，能够启动体内肿瘤生长、增强肿瘤干细胞的自我更新[13]。从MMTV-ErbB2/Neu转基因乳腺癌模型小鼠获得肿瘤细胞系，将 Twist2沉默后会引起细胞衰老，表现出细胞质扁平、G1期生长停滞、衰老相关β半乳糖(SA-β-gal)的活化及衰老标志 DEC1的出现等特性，该结果通过进一步的shRNA干预得到验证[14]。

在鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryo fibroblasts,MEFs)高表达 Twist2和活性形式的 H-RasV12，细胞表现恶性转化的特征，如接触抑制丢失、软琼脂中生长、裸鼠皮下注射后的高成瘤性。移植后表现出侵袭性肉瘤的组织学特性，包括有丝分裂异常、细胞核大小不均、血管生成活跃。表明Twist2和Ras蛋白有成瘤的协同作用[14]。

Twist2高表达与多种肿瘤的发生相关。Liang等[15]研究89例舌鳞状细胞癌(Tongue squamous cell carcinoma, TSCC)患者，发现Twist2高表达的占44.94%，而且表达水平与患者的无病生存期相关。Twist2、Snai1和 Snai2在头颈鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) 明显比正常组织高表达，而且Twist2过表达与HNSCC的分化级别差、低生存率及不良预后相关[16]。Zhou等[17]研究121例唾液腺囊癌(Adenoid cystic carcinoma, ACC)患者，42.98%表达高水平的 Twist2，并与嗜神经侵袭、局部复发及远端转移相关。Shimoda等[18]在ACC细胞系也发现转录因子Snail、Twist1、Twist2、Slug、Zeb1和 Zeb2表达均增高。在 93例结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)患者中，71%的样本高表达Twist2，表达部位主要在胞浆，是总生存率低的独立风险因素[19]。通过FISH分析12例人乳头状甲状腺癌(Papillary thyroid carcinoma, PTC)，83%的患者Twist2拷贝数增加[20]。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)非结构性蛋白NS5A能通过激活Twist2，诱导原代肝细胞致癌性转化和EMT[21]。

但Zhao等[22]在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)对照研究Twist1和2时，发现Twist1在细胞核高表达与HCC转移相关，其表达水平与E钙粘素的表达负相关，而 Twist2只在细胞浆表达，且与HCC的转移无相关性，也不影响细胞系 HepG2和PLC的侵袭能力。

另外，Twist2在骨肉瘤细胞发挥肿瘤抑制的作用。Ishikawa等[23]通过对比23份人骨肉瘤样本和9份正常骨髓基质细胞(Marrow stroma cell, MSC)发现，Twist2在骨肉瘤明显低表达，而且其表达水平与成瘤性呈现负相关。如在高成瘤性的骨肉瘤细胞高表达 Twist2，可起到轻微抑制体外细胞生长及明显抑制体内肿瘤形成的作用；相反，如在低成瘤性的骨肉瘤细胞将Twist2沉默，会促发肿瘤的形成。

在Ig VH(免疫球蛋白重链可变区)突变的CLL，转录因子Twist2选择性地沉默，表达水平与启动子区甲基化水平相关[24]。对77例成年和54例儿童急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者的研究发现，Twist2失活，比例分别占 68%和56%。其失活是由于启动子区高甲基化造成的，表观调控在RUNX1-ETV6融合阳性的病例中更普遍，复发的成年ALL中，几乎所有患者(91%)出现Twist2高甲基化[25]。

Twist2在多种肿瘤中出现表达水平的变化，但在不同肿瘤中的变化并不一致，整体上表达增高的情况占多数。

1.3 Twist2与EMT

EMT是有关形态发生的过程，细胞失去上皮特性如细胞极性、细胞间接触，并获得间质细胞特性如运动性增加[26]。肿瘤细胞EMT常伴有肿瘤抑制因子E钙粘素的表达丧失和N钙粘素的表达增加，E钙粘素不可逆失活的机制包括其基因座杂合丢失(Loss of heterozygosity, LOH)、编码区突变、启动子区甲基化以及转录抑制因子对 E-box的调节。转录抑制因子如 Twist2、Snail、Slug、ZEB和 E12/E47等对CDH1基因编码E钙粘素有抑制作用[27]。

Germanguz等[28]对斑马鱼中4种twist基因的表达模式进行研究，发现在入鞘/迁移细胞表达的Twist可能是从水母中保留下来，从两胚层动物到人类都保守，提出促进细胞移动可能是twist基因更古老原始的功能。

Twist2高表达后增强了细胞的迁移能力，出现上皮细胞标志下调、间质细胞标志上调，促进了EMT发生[13]。Twist2的表达位置决定肿瘤的进展：细胞质阳性的细胞膜表达E钙粘素，主要集中在肿瘤组织的中心；细胞核阳性则细胞膜无E钙粘素表达，分布在侵袭性肿瘤组织的前缘[29]。

Li等[30]发现 Twist2在宫颈癌胞浆和核内表达高，表达水平与宫颈上皮细胞恶性转变及宫颈癌组织学进程相关，与E钙粘素的表达水平负相关。多数宫颈癌患者死亡是由于转移和复发，人乳头瘤病毒(Human papilloma virus, HPV)促使宫颈正常上皮向上皮癌细胞转化，表现出间质特性，发生EMT进程，转录因子Snail、Twist1、Twist2和six1在复杂的调控过程中发挥作用[31]。Twist2在CRC高表达也与E钙粘素降低相关[20]。在HMECs，Twist2蛋白和有丝分裂相关的癌基因蛋白协同作用，如活化的Ras或ErbB2，导致EMT发生[13]。前列腺癌(Prostate cancer,PCa)细胞PC3高表达转录因子Twist 2，表现纤维细胞样形态，侵袭力增加，上皮细胞标志E钙粘素等下调，间质细胞标志纤连蛋白等上调，而将 Twist2沉默后上述表型逆转[32]。

仓鼠颊囊癌细胞能提高 Twist2的表达，TGF-β的下游效应因子p12CDK2-AP1(p12，Doc-1)可诱导EMT，因此认为EMT细胞发挥作用造成局部侵袭，而使非EMT细胞进入血流，在远端组织重建并生长[27]。

2 Twist2发挥作用的分子机制

Twist2发挥转录调控的功能，但在不同的组织和细胞以及机体发育的不同阶段，有不同的分子机制。

2.1 Twist2在成骨中发挥作用的机制

以成骨样细胞系 HSaOS-2为研究对象，发现Twist2和Twist1分别在成骨细胞和前成骨细胞阶段维持细胞、抑制分化(图1)，Twist2的表达可以改变成骨细胞对外部生长因子的应答，如碱性成纤维细胞生长因子bFGF，进而调节细胞内信号转导[6]。

Runx2是成骨细胞分化的充分必要条件，在骨骼发育早期，Twist2和Twist1在Runx2阳性的细胞内表达，而成骨细胞特异基因的表达仅在此 3个基因表达减弱时才出现，Twist2或Twist1的缺乏导致成骨分化的早现，Twist蛋白短暂抑制成骨细胞分化。Twist2在间质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)表达升高时，Runx2表达上升[33]。胰岛素受体(Insulin receptor, IR)信号通过抑制 Twist2，经由Runx2，控制成骨细胞的成长和骨钙蛋白的表达[34]。

Bialek等[35]提出 Twist蛋白抑制成骨作用是通过一个 Twist-box结构域所介导，只保留 N-末端和C-末端的缺失突变体 NCTwist，表现出比野生型更强的Runx2抑制作用，表明 Twist的抗成骨作用存在于C-末端，该末端在Twist蛋白保守。Twist-box可以与Runx2的DNA结合域相互作用而抑制其功能，并通过体内基因诱变证实了该结构域的功能。Zhang等[9]也阐明Twist蛋白不影响Runx2的基因表达，而是通过抑制Runx2活性，实现对成骨分化的调节。

表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)在骨骼系统发挥重要作用，成骨刺激可瞬时诱导肝素结合 EGF样生长因子(HB-EGF)和上皮调节蛋白(Epiregulin，EPR)表达，但用HB-EGF和EPR孵育前成骨细胞 MC3T3-E1，成骨分化被抑制。以上作用依赖 Ras，细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated kinase, ERK)通过Smad1的核定位和诱导Twist2调节Runx2活性[36]。

图1 Twist1和Twist2在早期骨细胞发育的功能模拟模式

在MSCs中，纤维母细胞生长因子2(Fibroblast growth factor, Fgf2)选择性地诱导Twist2和Spry4表达，而抑制Sfrp2和Runx2表达。Fgf2预处理MSCs，Erk1和Erk2的磷酸化延迟，并在成骨诱导期抑制了骨特异基因的表达，两个因素抑制了MSCs的分化[37]。

Twist1和2之间存在互相调节(Cross talk)，MC3T3细胞中外源Twist 1可激活内源Twist2的表达，外源Twist 2反过来可激活内源Twist1的表达；Twist蛋白与其他HLH蛋白间也存在交互调节(Cross regulate)[9]，在人成骨细胞系 MG63，Twist蛋白和 Id蛋白抑制E2A(E12或E47)-CBP蛋白复合物，该复合物在颅顶成骨细胞分化时常上调p21WAF/Cip1，后者抑制细胞周期依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase, CDKs)[38]，E2A和 Twist可与 Snail竞争结合 E-box，以控制p21WAF/Cip1表达，调节成骨细胞的生长和分化[39]。

2.2 Twist2在肿瘤中的作用机制

Twist2能与活化的 Ras协作，废除 p53和 Rb依赖的信号通路关键调节因子，破坏癌基因诱导的早衰。机体在肿瘤发展的早期，通过早衰来淘汰潜在的有害细胞，是肿瘤初始发展的屏障，Twist2蛋白是肿瘤发生早期的决定性驱动因子。在p53和Rb抑制肿瘤通路中，活性Ras诱导的p16Ink4a和p21Cip1可以被Twist2完全废除，Twist2可以抑制二者的启动子活性，ARF和p53水平未被下调[14]。

twist2基因缺陷导致小鼠的促炎细胞因子表达增强，在许多组织造成凋亡、恶病质、发育受限等后果，该现象归结于Twist2对细胞因子表达的抑制。鼠Twist2由细胞因子信号通路诱导，NF-κB通路的激活剂TNFα可诱发Twist2的表达增加。表达过程依赖背部相关蛋白 RelA，RelA缺陷小鼠检测不到twist基因、TNFα及IκBα表达。而多种细胞因子启动区包含bHLH蛋白的结合位点E-box，包括TNFα和IL-6等，表达的Twist又通过与RelA相互作用抑制细胞因子表达，Twist2的 C-末端也能抑制 RelA的活性，形成一个负性调控环(图2)[3]。突变小鼠的表型反映了该负性调控环的丧失。

图2 Twist对细胞因子表达的负性调控

Koh等[40,41]在研究CD7诱导凋亡的机制时，证实Twist2可以结合 NF-κB的 E-box，而负性调控未成熟T细胞中NF-κB介导的CD7启动子区的活性；发挥组蛋白去乙酰化作用，降低半乳凝素介导的凋亡。

2.3 Twist2在EMT发生中的作用机制

EMT相关的转录因子间存在互相调节，Twist2发挥转录调控的功能，抑制E钙粘素的表达，促使EMT的发生。Twist 2介导的早衰逃逸与EMT的发生相关，提示肿瘤细胞在恶性转变中获得转移能力可能是保护机制失效的副作用。Twist2本身的表达也受到其他因子的调控。在胃癌(Gastric cancer, GC)相关的细胞系HSC45转染Snail，EMT相关的转录因子twist2的mRNA水平增加8.2倍，twist1增加2.1倍，slug增加 20.9倍[42]。NF-κB2/p52在前列腺癌 LNCaP细胞系，可导致包括 Twist2在内的涉及细胞生长、增殖、移动和血管生成的多个基因上调[43]。twist2的mRNA表达被MEK或PI3激酶抑制剂所抑制[36]。

非转移性 PCa细胞系，用 TGF-β和 EGF处理可诱导 EMT。用活化的 Ras稳定转染细胞，Ras-Raf-MEK1信号级联放大对Erk2核内定位是必要的。Erk2与 TGF-β协同作用启动 EMT。转录因子c-Myc受Erk2磷酸化，对EMT是必需的。发生EMT的前列腺细胞表现出侵袭性，细胞梭形，E钙粘素丢失，波形蛋白、纤连蛋白、S100A4(钙结合蛋白A4，纤维母细胞特异蛋白1)表达增加，并表达与转移相关的基因MT-MMP1、MMP-2/9、MMP-9同源二聚体，及Twist2和Slug[44]。

TGF-β通过其细胞表面的受体和其下游因子Smad诱导EMT，Smad通路诱导核因子hmga2基因的表达，后者把转录因子Twist和Snail与TGF-β通路联系在一起，是 TGF-β诱发 EMT的充分必要条件。另外，TGF-β激活了 Smad3和 Smad4而诱导p12表达，通过与DNA多聚酶α和CDK2相互作用抑制生长，p12诱导的EMT是由Twist2调节的[27]。

3 结 语

Twist2作为转录因子，调节多种基因的表达，在不同组织中发挥着重要的调节功能，尤其在骨发育和肿瘤形成及肿瘤的进展和 EMT的发生过程中起重要的调节作用。Twist2的作用受到时空表达、磷酸化、二聚化和细胞定位调节。Twist2通过结合保守的 E-box序列，招募共激活物或抑制剂，或通过蛋白-蛋白相互作用，形成二聚物，发挥激活/抑制的调节作用。与Twist2相关的相互作用因子见表1。

目前对Twist2调控基因的研究还很有限，既没有阐明Twist2对每个基因调节作用的具体方式，也没有全面的直接比较Twist2与Twist1两种蛋白质作用的重叠与区别。使用ChIP-Chip和ChIP-Seq技术可能会有助于全面分析转录因子在整个基因组的结合情况，将有利于明确Twist2所调控的基因、结合的部位，以及进行特异性比较Twist1和Twist2之间的调控差异。因此，进一步综合分析Twist1与Twist2在 DNA的结合位置、染色质结构特点和转录后修饰，有望了解Twist2蛋白的调节转录机制。

表1 与Twist2相关的相互作用因子

[1]Li L, Cserjesi P, Olson EN.Dermo-1: a novel twist- related bHLH protein expressed in the developing dermis.Dev Biol, 1995, 172(1): 280–292.

[2]Gitelman I.Evolution of the vertebrate twist family and synfunctionalization: a mechanism for differential gene loss through merging of expression domains.Mol Biol Evol, 2007, 24(9): 1912–1925.

[3]Šošić D, Richardson JA, Yu K, Ornitz DM, Olson EN.Twist regulates cytokine gene expression through a negative feedback loop that represses NF-κB activity.Cell,2003, 112(2): 169–180.

[4]Perrin-Schmitt F, Bolcato-Bellemin AL, Bourgeois P,Stoetzel C, Danse JM.The locations of the H-twist and H-dermo-1 genes are distinct on the human genome.Biochim Biophys Acta, 1997, 1360(1): 1–2.

[5]Benezra R, Davis RL, Lockshon D, Turner DL, Weintraub H.The protein Id: a negative regulator of helix-loop-helix DNA binding proteins.Cell, 1990, 61(1): 49–59.

[6]Lee MS, Lowe G, Flanagan S, Kuchler K, Glackin CA.Human Dermo-1 has attributes similar to twist in early bone development.Bone, 2000, 27(5): 591–602.

[7]Tukel T, Šošić D, Al-Gazali LI, Erazo M, Casasnovas J,Franco HL, Richardson JA, Olson EN, Cadilla CL, Desnick RJ.Homozygous nonsense mutations in TWIST2 cause Setleis syndrome.Am J Hum Genet, 2010, 87(2): 289–296.

[8]Tamura M, Noda M.Identification of DERMO-1 as a member of helix-loop-helix type transcription factors expressed in osteoblastic cells.J Cell Biochem, 1999, 72(2):167–176.

[9]Zhang Y, Hassan MQ, Li ZY, Stein JL, Lian JB, van Wijnen AJ, Stein GS.Intricate gene regulatory networks of helix-loop-helix (HLH) proteins support regulation of bone- tissue related genes during osteoblast differentiation.J Cell Biochem, 2008, 105(2): 487–496.

[10]Osathanon T, Ritprajak P, Nowwarote N, Manokawinchoke J,Giachelli C, Pavasant P.Surface-bound orientated Jagged-1 enhances osteogenic differentiation of human periodontal ligament-derived mesenchymal stem cells.J Biomed Mater Res A, 2013, 101(2): 358–367.

[11]Huang YY, Meng T, Wang SZ, Zhang H, Mues G, Qin CL,Feng JQ, D'Souza RN, Lu YB.Twist1- and twist2-haploinsufficiency results in reduced bone formation.PLoS One,2014, 9(6): e99331.

[12]Franco HL,Casasnovas J, Rodríguez-Medina JR, Cadilla CL.Redundant or separate entities?-roles of Twist1 and Twist2 as molecular switches during gene transcription.Nucleic Acids Res, 2011, 39(4): 1177–1186.

[13]Fang X, Cai Y, Liu J, Wang Z, Wu Q, Zhang Z, Yang CJ,Yuan L, Ouyang G.Twist2 contributes to breast cancer progression by promoting an epithelial-mesenchymal transition and cancer stem-like cell self-renewal.Oncogene,2011, 30(47): 4707–4720.

[14]Ansieau S, Bastid J, Doreau A, Morel AP, Bouchet BP,Thomas C, Fauvet F, Puisieux I, Doglioni C, Piccinin S,Maestro R, Voeltzel T, Selmi A, Valsesia-Wittmann S,Caron DFC, Puisieux A.Induction of EMT by twist proteins as a collateral effect of tumor-promoting inactivation of premature senescence.Cancer Cell, 2008, 14(1): 79–89.

[15]Liang XH, Zheng M, Jiang JA, Zhu GQ, Yang J, Tang YL.Hypoxia-inducible factor-1 α, in association with TWIST2 and SNIP1, is a critical prognostic factor in patients with tongue squamous cell carcinoma.Oral Oncol, 2011, 47(2):92–97.

[16]Gasparotto D, Polesel J, Marzotto A, Colladel R, Piccinin S, Modena P, Grizzo A, Sulfaro S, Serraino D, Barzan L,Doglioni C, Maestro R.Overexpression of TWIST2 correlates with poor prognosis in head and neck squamous cell carcinomas.Oncotarget, 2011, 2(12): 1165–1175.

[17]Zhou CC, Liu JR, Tang YL, Zhu GQ, Zheng M, Jiang J,Yang J, Liang XH.Coexpression of hypoxia-inducible factor-2α, TWIST2, and SIP1 may correlate with invasion and metastasis of salivary adenoid cystic carcinoma.J Oral Pathol Med, 2012, 41(5): 424–431.

[18]Shimoda M, Sugiura T, Imajyo I, Ishii K, Chigita S, Seki K,Kobayashi Y, Shirasuna K.The T-box transcription factor Brachyury regulates epithelial-mesenchymal transition in association with cancer stem-like cells in adenoid cystic carcinoma cells.Bmc Cancer, 2012, 12: 377.

[19]Yu H, Jin GZ, Liu K, Dong H, Yu H, Duan JC, Li Z, Dong W, Cong WM, Yang JH.Twist2 is a valuable tic biomarker for colorectal cancer.World J Gastroenterol,2013, 19(15): 2404–2411.

[20]Heiliger KJ, Hess J, Vitagliano D, Salerno P, Braselmann H, Salvatore G, Ugolini C, Summerer I, Bogdanova T,Unger K, Thomas G, Santoro M, Zitzelsberger H.el candidate genes of thyroid tumourigenesis identified in Trk-T1 transgenic mice.Endocr-Relat Cancer, 2012,19(3): 409–421.

[21]Akkari L, Gregoire D, Floc'H N, Moreau M, Hernandez C,Simonin Y, Rosenberg AR, Lassus P, Hibner U.Hepatitis C viral protein NS5A induces EMT and participates in oncogenic transformation of primary hepatocyte precursors.J Hepatol, 2012, 57(5): 1021–1028.

[22]Zhao XL, Sun T, Che N, Sun D, Zhao N, Dong XY, Gu Q,Yao Z, Sun BC.Promotion of hepatocellular carcinoma metastasis through matrix metalloproteinase activation by epithelial-mesenchymal transition regulator Twist1.J Cell Mol Med, 2011, 15(3): 691–700.

[23]Ishikawa T, Shimizu T, Ueki A, Yamaguchi SI, Onishi N,Sugihara E, Kuninaka S, Miyamoto T, Morioka H, Nakayama R, Kobayashi E, Toyama Y, Mabuchi Y, Matsuzaki Y,Yamaguchi R, Miyano S, Saya H.Twist2 functions as a tumor suppressor in murine osteosarcoma cells.Cancer Sci, 2013, 104(7): 880–888.

[24]Raval A, Lucas DM, Matkovic JJ, Bennett KL, Liyanarachchi S, Young DC, Rassenti L, Kipps TJ, Grever MR,Byrd JC, Plass C.TWIST2 demonstrates differential methylation in immunoglobulin variable heavy chain mutated and unmutated chronic lymphocytic leukemia.J Clin Oncol, 2005, 23(17): 3877–3885.

[25]Thathia SH, Ferguson S, Gautrey HE, van Otterdijk SD,Hili M, Rand V, Moorman AV, Meyer S, Brown R,Strathdee G.Epigenetic inactivation of TWIST2 in acute lymphoblastic leukemia modulates proliferation, cell survival and chemosensitivity.Haematologica, 2012, 97(3):371–378.

[26]Hugo H, Ackland ML, Blick T, Lawrence MG, Clements JA, Williams ED, Thompson EW.Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transitions in carcinoma progression.J Cell Physiol, 2007, 213(2): 374–383.

[27]Tsuji T, Ibaragi S, Shima K, Hu MG, Katsurano M, Sasaki A, Hu GF.Epithelial-mesenchymal transition induced by growth suppressor p12CDK2-AP1 promotes tumor cell local invasion but suppresses distant colony growth.Cancer Res, 2008, 68(24): 10377–10386.

[28]Germanguz I, Lev D, Waisman T, Kim CH, Gitelman I.Four twist genes in zebrafish, four expression patterns.DevDyn, 2007, 236(9): 2615–2626.

[29]Mao YB, Zhang NN, Xu JF, Ding ZJ, Zong RR, Liu ZG.Significance of heterogeneous Twist2 expression in human breast cancers.PLoS One, 2012, 7(10): e48178.

[30]Li Y, Wang W, Wang WW, Yang RF, Wang T, Su TF, Weng DH, Tao T, Li W, Ma D, Wang SX.Correlation of TWIST2 up-regulation and epithelial-mesenchymal transition duringtumorigenesis and progression of cervical carcinoma.Gynecol Oncol, 2012, 124(1): 112–118.

[31]Lee MY, Shen MR.Epithelial-mesenchymal transition in cervical carcinoma.Am J Transl Res, 2012, 4(1): 1–13.

[32]Celià-Terrassa T, Meca-Cortés Ó, Mateo F, de Paz AM,Rubio N, Arnal-Estapé A, Ell BJ, Bermudo R, Díaz A,Guerra-Rebollo M, Lozano JJ, Estarás C, Ulloa C, Álvarez-Simón D, Milà J, Vilella R, Paciucci R, Martínez-Balbás M, de Herreros AG, Gomis RR, Kang YB, Blanco J,Fernández PL, Thomson TM.Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells.J Clin Invest, 2012, 122(5):1849–1868.

[33]Isenmann S, Arthur A, Zannettino AC, Turner JL, Shi S,Glackin CA, Gronthos S.TWIST family of basic helix-loop-helix transcription factors mediate human mesenchymal stem cell growth and commitment.Stem Cells,2009, 27(10): 2457–2468.

[34]Fulzele K, Riddle RC, DiGirolamo DJ, Cao XM, Wan C,Chen DQ, Faugere MC, Aja S, Hussain MA, Bruning JC,Clemens TL.Insulin receptor signaling in osteoblasts regulates postnatal bone acquisition and body composition.Cell, 2010, 142(2): 309–319.

[35]Bialek P, Kern B, Yang XL, Schrock M, Sosic D, Hong N,Wu H, Yu K, Ornitz DM, Olson EN, Justice MJ, Karsenty G.A twist code determines the onset of osteoblast differentiation.Dev Cell, 2004, 6(3): 423–435.

[36]Nakamura T, Toita H, Yoshimoto A, Nishimura D, Takagi T, Ogawa T, Takeya T, Ishida-Kitagawa N.Potential involvement of Twist2 and Erk in the regulation of osteoblastogenesis by HB-EGF-EGFR signaling.Cell Struct-Funct, 2010, 35(1): 53–61.

[37]Lai WT, Krishnappa V, Phinney DG.Fibroblast growth factor 2 (Fgf2) inhibits differentiation of mesenchymal stem cells by inducing Twist2 and Spry4, blocking extracellular regulated kinase activation, and altering Fgf receptor expression levels.Stem Cells, 2011, 29(7): 1102–1111.

[38]Funato N, Ohtani K, Ohyama K, Kuroda T, Nakamura M.Common regulation of growth arrest and differentiation of osteoblasts by helix-loop-helix factors.Mol Cell Bio, 2001,21(21): 7416–7428.

[39]Takahashi E, Funato N, Higashihori N, Hata Y, Gridley T,Nakamura M.Snail regulates p21WAF/CIP1expression in cooperation with E2A and Twist.Biochem Biophys Res Commun, 2004, 325(4): 1136–1144.

[40]Koh HS, Lee C, Lee KS, Ham CS, Seong RH, Kim SS,Jeon SH.CD7 expression and galectin-1-induced apoptosis of immature thymocytes are directly regulated by NF-κB upon T-cell activation.Biochem Biophys Res Commun,2008, 370(1): 149–153.

[41]Koh HS, Lee C, Lee KS, Park EJ, Seong RH, Hong S,Jeon SH.Twist2 regulates CD7 expression and galectin-1-induced apoptosis in mature T-cells.Mol Cells, 2009,28(6): 553–558.

[42]Masuda R, Semba S, Mizuuchi E, Yanagihara K, Yokozaki H.Negative regulation of the tight junction protein tricellulin by snail-induced epithelial-mesenchymal transition in gastric carcinoma cells.Pathobiology, 2010, 77(2): 106–113.

[43]Nadiminty N, Dutt S, Tepper C, Gao AC.Microarray analysis reveals potential target genes of NF-κB2/p52 in LNCaP prostate cancer cells.Prostate, 2010, 70(3): 276–287.

[44]Amatangelo MD, Goodyear S, Varma D, Stearns ME.c-Myc expression and MEK1-induced Erk2 nuclear localization are required for TGF-beta induced epithelial-mesenchymal transition and invasion in prostate cancer.Carcinogenesis, 2012, 33(10): 1965–1975.