miRNA-411对乳癌细胞侵袭和迁移的影响

房建凯，陈枉枉，郭玲玲

(苏州大学医学部,江苏 苏州 215213 1 病理学与病理生理学教研室； 2 解剖学教研室暨细胞神经生物学研究室)



miRNA-411对乳癌细胞侵袭和迁移的影响

房建凯1，陈枉枉2，郭玲玲1

(苏州大学医学部,江苏 苏州 215213 1 病理学与病理生理学教研室； 2 解剖学教研室暨细胞神经生物学研究室)

目的 探讨微小RNA-411(miRNA-411)对人乳癌细胞株MDA-MB-231增殖、侵袭和迁移的影响。方法 采用实时定量PCR方法检测高转移性乳癌细胞MDA-MB-231与低转移性乳癌细胞MCF-7中miRNA-411的表达。采用LipofectamineTM2000将miRNA-411成熟子(Mimic)转染至MDA-MB-231细胞中，通过采用实时定量PCR方法检测miRNA-411 Mimic的转染效率，Transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力,免疫蛋白印迹法检测E-钙黏素(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达，MTT实验检测MDA-MB-231细胞的增殖能力。结果miRNA-411在MDA-MB-231细胞中的表达水平显著低于MCF-7细胞(t=7.45,P<0.01)。miRNA-411 Mimic瞬时转染MDA-MB-231细胞后，其迁移和侵袭能力均受到明显的抑制(t=7.24、6.62,P<0.01)，而且经转染的细胞E-cadherin表达升高，而Vimentin表达下降。然而，miRNA-411 Mimic对MDA-MB-231细胞增殖能力无明显影响(P>0.05)。结论 miRNA-411在高转移性乳癌细胞中低表达，转染miRNA-411 Mimic后乳癌细胞MDA-MB-231迁移和侵袭能力明显减弱，其迁移和侵袭能力的下降并非通过降低MDA-MB-231细胞的增殖能力所致，而是可能通过逆转MDA-MB-231细胞的上皮-间质转化过程实现的。

乳房肿瘤；MDA-MB-231；miRNA-411；细胞运动；肿瘤侵润

乳癌是一种常见的恶性肿瘤，目前已位于女性恶性肿瘤首位，其发病率呈逐年上升的趋势，而肿瘤发生转移是导致乳癌病人死亡的首要原因[1]。业已证实，微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码短链RNA，在转录后水平通过与靶基因mRNA的3′端非编码区(3-UTR)互补，破坏目标特异性基因的转录产物，调控肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等相关基因的表达，进而影响肿瘤的发生发展和恶性转变[2-3]。上皮-间质转化(EMT)是肿瘤细胞发生转移的第一步，其机制是细胞间黏附能力的逐渐丧失和细胞迁移能力的逐渐增强。研究结果表明，在EMT 过程中肿瘤细胞表型会发生变化，上皮细胞特性消失，而出现间质细胞的特性，同时其迁移和运动能力增强[4]。有文献研究结果表明，相比正常腺体组织，miRNA-411在乳癌组织中表达水平下降[5]。有关miRNA-411对乳癌细胞生物学行为影响的研究尚少。本课题旨在研究miRNA-411在低转移性乳癌细胞和高转移性乳癌细胞中表达水平的差异，并通过进一步的体外实验探讨miRNA-411对乳癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1细胞株与培养

人乳癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231购于中国科学院细胞库，使用含有体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养。

1.2主要试剂与仪器

DMEM培养基购自美国Hlyclone公司，细胞总RNA提取试剂盒购自北京天根公司，反转录试剂盒购买自美国Thermo公司，Real-time PCR试剂盒购自美国罗氏公司，转染试剂LipofectamineTM2000、Opti-MEM培养基、miRNA-411成熟子(Mimic)以及Scrambled Mimic均产自美国Invitrogen公司，Transwell小室购自美国Corning公司，E-cadherin抗体和Vimentin抗体均购自Abcam公司。

1.3Real-time PCR 方法检测miRNA-411表达

分别提取MDA-MB-231和MCF-7两种乳癌细胞的总RNA并将其反转录为cDNA。利用cDNA对miRNA-411表达量进行Real-time PCR检测，其中miRNA-411的上游引物序列为5′-GGGGGGTAGTAGACGACCGTATAG-3′，下游引物序列为5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′(康成公司合成)。以cDNA为模版，U6为内参照，按Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)说明书进行扩增，设置3个复孔。反应条件:95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s、60 ℃退火与延伸60 s，共40个循环。以2-△△Ct值表示miRNA-411的相对表达量。

1.4miRNA-411 Mimic转染MDA-MB-231细胞

将miRNA-411 Mimic(序列为UAGUAGACCGUAUAGCGUACG)、Scrambled Mimic(序列为CAGUACUUUUGUGUAGUACAA，该序列为无义序列)粉末离心后，采用ddH2O将其溶解配制成浓度为20 μmol/L的溶液。转染前1 d铺6孔板，待细胞融合度达到80%左右进行转染。将稀释后的miRNA-411 Mimic和LipofectamineTM2000混合，室温孵育20 min。将混合液加入6孔板中，继续培养24 h后，提取总RNA进行Real-time PCR反应，测量miRNA-411 Mimic转染实验组和Scrambled Mimic转染实验组的miRNA-411的表达水平。

1.5细胞迁移实验检测miRNA-411 Mimic对于MDA-MB-231细胞迁移能力的影响

将实验组分成miRNA-411 Mimic转染实验组、Scrambled Mimic转染实验组和未转染实验组(Mock组)，将MDA-MB-231细胞消化离心，用无血清培养基调整细胞密度至108/L。取200 μL该细胞悬液加入小室中，在下室加入500 μL完全培养基，继续培养24 h后，取出小室，以40 g/L的多聚甲醛溶液固定，结晶紫染色后，取100 μm边长等面积计算细胞数量。

1.6细胞侵袭实验检测miRNA-411 Mimic对于MDA-MB-231 细胞侵袭能力的影响

实验前1 d将基质胶与无血清培养基按1∶5比例铺于小室中，置于37 ℃的培养箱中孵育过夜。然后，将实验组分成miRNA-411 Mimic转染实验组、Scrambled Mimic转染实验组和未转染实验组，将MDA-MB-231细胞消化离心，用无血清培养基调整细胞密度至108/L。取200 μL该细胞悬液加入小室中，在下室加入500 μL完全培养基，培养24 h后，取出小室，以40 g/L的多聚甲醛溶液固定，结晶紫染色后，在显微镜下计数不同视野下细胞数目。

1.7Western blotting检测miRNA-411 Mimic对MDA-MB-231 EMT过程的影响

将实验组分成miRNA-411 Mimic转染实验组、Scrambled Mimic转染实验组和未转染实验组，在6孔板中转染细胞48 h后，裂解细胞，提取蛋白质，然后测定E-钙黏素(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)水平。

1.8MTT方法检测miRNA-411 Mimic对MDA-MB-231细胞增殖的影响

将实验组分成miRNA-411 Mimic转染实验组、Scrambled Mimic转染实验组和未转染实验组，每组设置5个复孔。然后于96孔板中转染细胞，待72 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，培养箱中孵育4 h后，每孔加入DMSO溶液150 μL，振荡15 min，采用酶标仪测定在波长570 nm处光密度(OD)值。

1.9统计学处理

2 结 果

2.1miRNA-411在两种细胞中的表达水平

miRNA-411在高转移性乳癌细胞MDA-MB-231中的表达水平为0.09±0.01，而低转移性乳癌细胞MCF-7的表达水平为1.00±0.07，两者比较差异有显著性(t=7.45，P<0.01)。

2.2miRNA-411 Mimic转染MDA-MB-231细胞对miRNA-411表达量的影响

本文利用LipofectamineTM2000将miRNA-411 Mimic转染MDA-MB-231细胞，转染后24 h，对转染细胞的miRNA-411表达量进行定量测定。结果表明，Scrambled Mimic转染实验组表达水平为1.00±0.07，miRNA-411 Mimic转染实验组表达水平为61.01±5.04，两者比较差异有显著意义(t=5.74，P<0.01)。

2.3miRNA-411 Mimic对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响

细胞迁移实验结果显示，miRNA-411 Mimic转染实验组细胞迁出数量为23.73±2.21，Scrambled Mimic转染实验组为71.02±4.51，两者比较差异有显著性(t=7.24，P<0.01)。但Scrambled Mimic转染实验组细胞迁出数量为71.02±4.51，未转染实验组为76.05±5.43，两组相比较差异无显著意义(P>0.05)。细胞侵袭实验结果显示，miRNA-411 Mimic转染实验组细胞降解基质胶并且迁出的数量为23.92±3.52，Scrambled Mimic转染实验组为67.68±5.28，两者比较差异有显著意义(t=6.62，P<0.01)；而Scrambled Mimic转染实验组与未转染实验组(72.35±6.53)比较，差异无显著性(P>0.05)。见图1。

2.4miRNA-411 Mimic 对于MDA-MB-231 细胞EMT 过程的影响

细胞转染48 h后，miRNA-411 Mimic转染组细胞E-cadherin蛋白表达相比Scrambled Mimic 转染组有所提高，而未转染组与Scrambled Mimic 转染组间并无明显差异。而miRNA-411 Mimic转染组细胞Vimentin蛋白表达相比Scrambled Mimic转染组有所下降，而未转染组与Scrambled Mimic转染组间并无明显差异。见图2。

图1 miRNA-411 Mimic抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力(结晶紫染色，100倍)

图2 miRNA-411 Mimic转染对E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响

2.5miRNA-411 Mimic对MDA-MB-231细胞增殖的影响

细胞转染72 h后， miRNA-411 Mimic转染组细胞的增殖能力为0.43±0.05，Scrambled Mimic转染组为0.49±0.03，未转染组为0.45±0.01，前者及后者与Scrambled Mimic 转染组比较差异无显著意义(P>0.05)。

3 讨 论

乳癌发病率位于女性恶性肿瘤首位，其转移是导致乳癌病人死亡的首要原因[6]。因此，抑制乳癌转移成为乳癌治疗的关键。目前的研究结果显示，miRNA参与乳癌发生发展，并最终导致乳癌浸润和转移。Vimentin蛋白是间质细胞表面标记物，其在上皮性肿瘤细胞中高表达是EMT发生的重要标志；E-cadherin蛋白是上皮细胞表面标记物，其表达的丢失是EMT发生的另一重要标志[4]；逆转肿瘤细胞EMT的发生，使其重新表达E-cadherin蛋白，是抑制肿瘤细胞的侵袭和转移的重要措施[7]。

miRNAs在EMT中充当增强剂或抑制剂。例如，Twist能诱导miRNA-10b表达，这种miRNA能够抑制HOXD10蛋白的翻译并造成RhoC表达升高，促进乳癌细胞EMT的发生，从而促进乳癌细胞转移[8]。与之作用相反，miRNA-31通过协调抑制一系列促转移基因(包括RhoA)，抑制EMT过程，从而抑制乳癌转移[9]。

既往研究结果显示，miRNA-411在乳癌组织中表达下调[5]。本研究结果显示，相比低转移性乳癌细胞，miRNA-411在高转移性乳癌细胞中的表达水平更低，瞬时转染miRNA-411 Mimic，乳癌细胞MDA-MB-231的迁移与侵袭能力均明显减弱，提示miRNA-411能够抑制乳癌细胞的侵袭和迁移能力。E-cadherin是上皮细胞的重要标志物，MDA-MB-231细胞转染miRNA-411 Mimic后，E-cadherin蛋白的水平显著上调，而间质细胞的标记分子Vimentin表达水平则明显下降。但是miRNA-411 Mimic对乳癌细胞MDA-MB-231的增殖没有影响，说明miRNA-411对乳癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭的影响，不是通过抑制乳癌细胞的增殖能力，而是可能通过逆转乳癌MDA-MB-231的EMT过程来实现。

综上所述，miRNA-411可能通过抑制乳癌细胞EMT的发生，从而抑制乳癌细胞的侵袭和转移。本研究为乳癌的诊断和治疗提供了一个新的思路，miRNA-411可以作为预测乳癌侵袭和转移的标志，还可成为乳癌治疗新靶点，这对于提高乳癌病人的生存率会起到极大的帮助。

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(本文编辑 厉建强)

EFFECT OF MIRNA-411 ON INVASION AND MIGRATION OF HUMAN BREAST CANCER CELLS

FANGJiankai,CHENWangwang,GUOLingling

(Department of Pathology and Pathophysiology, Medical College of Soochow University, Suzhou 215213, China)

ObjectiveTo investigate the impact of microRNA-411 (miRNA-411) on proliferation, migration and invasion of human breast cancer cell line MDA-MB-231.MethodsThe expression of miRNA-411 was detected in highly metastatic breast cancer MDA-MB-231 cells and lowly metastatic breast cancer MCF-7 cells by real-time PCR assay. Employing LipofectamineTM2000, miRNA-411 mimic was transfected into breast cancer MDA-MB-231 cells. The transfection efficiency of miRNA-411 mimic was detected by real-time PCR assay, and the migration and ability of the cells measured by Transwell assay, the expressions of E-cadherin and vimentin by Western blotting, and the proliferation of the cells by MTT assay.ResultsThe expression of miRNA-411 in MDA-MB-231 cells was significantly lower than MCF-7 cells (t=7.45,P<0.01). After miRNA-411 mimic was transiently transfected into MDA-MB-231 cells, the migration and invasion of MDA-MB-231 cells were significantly inhibited (t=7.24,6.62;P<0.01). The expression of E-cadherin in infected cells elevated, and that of Vimentin declined. No significant impact of miRNA-411 mimic on the reproductive activity of MDA-MB-231 cells was noted (P>0.05).ConclusionmiRNA-411 is lowly expressed in highly metastatic breast cancer cells. The migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells are significantly inhibited after transfection with miRNA-411 mimic, the suppression of the migration and invasion is not due to reducing the proli-feration ability of MDA-MB-231 cells, but possibly through inversion of epithelial-mesenchymal transition of MDA-MB-231 cells.

breast neoplasms; MDA-MB-231; miRNA-411; cell movement; neoplasm invasiveness

2015-05-15;

2015-08-17

房建凯(1990-)，男，硕士研究生。

郭玲玲(1963-)，女，硕士，副教授。

R737.9

A

1008-0341(2015)06-0637-04