eIF-4A在不同宫颈组织中的表达及其临床意义

桑昌美，马德花，朱德璋，隋爱华，赵淑萍

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266003 1 妇科； 2 麻醉科； 3 中心实验室)



eIF-4A在不同宫颈组织中的表达及其临床意义

桑昌美1，马德花1，朱德璋2，隋爱华3，赵淑萍1

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266003 1 妇科； 2 麻醉科； 3 中心实验室)

目的 探讨真核细胞起始因子4A (eIF-4A)在不同宫颈组织中的表达及其临床意义。方法 采用荧光实时定量PCR以及Western-blot方法，检测30例正常宫颈组织、26例低级别宫颈上皮内瘤变组织、25例高级别宫颈上皮内瘤变组织以及44例宫颈癌组织中eIF-4A mRNA及蛋白的表达情况，并分析宫颈癌组织中eIF-4A的表达与其临床病理特征间的关系。结果 与正常宫颈组织相比，eIF-4A蛋白及mRNA在低级别上皮内瘤变组织、高级别上皮内瘤变组织、宫颈癌组织中的表达量逐渐增高，4组间比较差异有显著性(F=11.07、14.17，P<0.05)；宫颈癌组织中eIF-4A mRNA及蛋白的表达与其组织学分级、是否发生淋巴转移有关(F=20.03、19.77，t=7.99、5.38，P<0.05)。结论 eIF-4A的在宫颈上皮内瘤变组织及宫颈癌组织高表达，提示eIF-4A在宫颈癌的发生、发展中可能起一定的作用，有可能成为判断宫颈癌发生及预后的分子标志之一。

真核细胞起始因子4A；宫颈肿瘤；宫颈上皮内瘤样病变；预后

宫颈癌是女性第二大常见的恶性肿瘤[1]。近年来，宫颈癌发病率明显增高且发病年龄呈低龄化趋势。高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染被认为是宫颈癌发生的最危险因素[2]。但其发病机制尚未完全阐明。真核细胞起始因子4A(eIF-4A)是DEAD盒家族的一员[3]，具有RNA依赖的ATP酶和RNA解螺旋酶活性，在蛋白合成的起始过程中发挥重要作用。研究表明，eIF-4A与肿瘤的发生发展相关，是细胞增殖和癌变的一个关键点[4-6]。有关eIF-4A与宫颈癌关系的研究较少。本文探讨eIF-4A在不同宫颈组织中的表达及其意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年9月—2012年8月在我院行宫颈活检或手术治疗病人的标本，其中低度上皮内瘤变组织(CINⅠ级)26例，高度CIN组织(CINⅡ～Ⅲ级)25例，宫颈癌组织44例，以及同期因子宫肌瘤行全子宫切除术后病理证实为正常宫颈组织30例。所有病人术前未行放、化疗，临床和病理资料完整。宫颈癌病人年龄24～65岁，中位年龄43岁；宫颈癌组织学分级：高分化(G1)12例，中分化(G2)14例，低分化(G3)18例；临床分期:ⅠB1-B2期23例，ⅡA期21例；病理类型：鳞癌27例，非鳞癌17例；有淋巴结转移16例，无淋巴结转移28例。

1.2 试剂及来源

兔抗人eIF-4A多克隆抗体购自美国Abcam公司；SP免疫组织化学试剂盒、DAB染色剂、山羊抗兔辣根过氧化物酶IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RNA提取试剂盒Trizol Reagant及PrimeScriptTMRTreagent Kit(Perfect Real Time)购自大连宝生生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 标本处理

所有宫颈组织标本离体后切成直径3～5 mm的组织块装入无RNA酶的EP管中，立即放入液氮中，后于-80 ℃冰箱内保存。

1.4 实验方法

1.4.1 实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测eIF-4A mRNA的表达 取50～100 mg组织按照说明书要求的步骤提取总RNA，逆转录合成cDNA后，取2 μL进行Real-time PCR。eIF-4A上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；GAPDH上游引物:5′-CTGAAGCACCACATATTG-3′，下游引物：5′-CAACACAACCTGAATACTT-3′。PCR循环参数：95 ℃ 10 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共进行40个循环。检测目的基因的扩增效率和管家基因的扩增效率一致，采用△△Ct方法进行相对定量。

1.4.2 Western-blot方法检测eIF-4A蛋白的表达取50～100 mg组织，加入RIPA蛋白裂解液，研磨离心后取上清液，置于-20 ℃保存。采用BCA法检测蛋白浓度后进行蛋白变性。取等量变性蛋白在100 g/L的PAGE凝胶上电泳，转膜、封闭，加入一抗4 ℃过夜。漂洗后加入二抗孵育，再次漂洗后进行显影。采用Quantity-One 4.6.2软件进行灰度值分析，结果以每条带所占比例进行表示。

2 结 果

2.1 Real-time PCR及Western-blot方法检测不同宫颈组织中eIF-4A mRNA及蛋白的表达eIF-4A mRNA在正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组织相对表达量分别为1.00、1.22、1.27、2.27,4组比较差异有显著性(F=11.07，P<0.05)。eIF-4A蛋白在正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组织的相对表达量分别为17.33±1.67、18.19±1.62、23.86±2.93、25.17±2.30，4组间比较差异有显著性(F=14.17，P<0.05)。见图1。

2.2 宫颈癌组织中eIF-4A mRNA及蛋白表达与临床病理参数间的关系

eIF-4A mRNA及蛋白的相对表达量与宫颈癌组织学分级及是否有淋巴结转移有关(F=20.03、19.77，t=7.99、5.38，P<0.05)；而与组织病理类型和临床分期无关(P>0.05)。见表1。

3 讨 论

eIF-4F是由eIF-4A、eIF-4E和eIF-4G组成的三聚体。eIF-4F与真核细胞mRNA的帽状结构的结合是蛋白翻译的起始。eIF-4E能够识别并且直接结合于帽状结构，将mRNA和40S核糖体连结起来，并作为支架蛋白与eIF-4A、eIF-4E相互作用。在40S核糖体募集之后，eIF-4F结合到帽状结构上，形成的43S起始前复合物开始扫描5′-端非翻译区(5′-UTR)，直到起始密码子的出现。eIF-4A是eIF-4F复合物中含量最多的起始因子，它是一种ATP依赖的RNA解螺旋酶、ATP依赖性RNA结合蛋白，能够打开mRNA 5′非翻译区的二级结构，以促进核糖体的结合。

①正常宫颈组织，②CINⅠ组织，③CINⅡ～Ⅲ组织，④宫颈癌组织。

表1 宫颈癌组织中eIF-4A mRNA及蛋白表达与临床病理参数间的关系

研究显示，起始因子生理限制的解除可以导致癌基因蛋白合成增加。而对eIF-4A翻译起始调控敏感的基因包括许多的原癌基因以及转录调节因子，如MYC、MYB、NOTCH、CDK6、BCL2等[7]。eIF-4A mRNA在黑色素瘤组织表达量是正常黑色素细胞的5倍[4]。本研究结果显示，与正常宫颈组织相比，eIF-4A在正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组织中的表达量逐渐升高。将eIF-4A基因敲除以及eIF-4A主要结构体的突变均可以抑制蛋白的合成[8]；而在体外，加入eIF-4A拮抗剂也可抑制肿瘤的发生[9]。eIF-4A在上皮内瘤变组织、宫颈癌组织中表达量增多，提示其表达的升高是宫颈癌发生的早期事件，可能参与了宫颈癌的发展过程。因此，eIF-4A可作为判断宫颈癌发生的可靠指标。

目前，明确判断宫颈癌预后的有效因素主要是盆腔淋巴结转移，而其他临床病理因素对预测宫颈癌预后亦有重要价值，如肿瘤病理类型、临床分期、分化级别、肌层浸润深度、脉管内瘤栓转移情况及手术切缘均可能与宫颈癌预后相关[10]。本实验亦检测eIF-4A在宫颈癌组织中的表达量，并分析其与部分临床病理参数的关系，结果显示，宫颈癌组织学分级越低，恶性程度越高，eIF-4A的表达量越高。癌组织的恶性程度越高，则细胞生长速度越快，所需蛋白合成的速度越快、数量越多。盆腔淋巴结转移者的eIF-4A表达水平明显高于无盆腔淋巴结转移者。淋巴结转移是宫颈癌最主要转移方式。eIF-4A表达与盆腔淋巴结转移密切相关。说明淋巴结是eIF-4A分子的重要靶点，肿瘤细胞通过提高eIF-4A的表达，诱导淋巴管的生成以及肿瘤的转移。然而，在本研究中，eIF-4A的表达与其临床分期无明显关系。在临床上，只有ⅠB1～ⅡA期的宫颈癌病人才能直接接受手术治疗，且本研究中宫颈癌组织标本相对较少，可能对此实验结果有一定的影响。宫颈癌中eIF-4A的表达量与其组织病理类型无关，这可能是由于不管是鳞状细胞癌还是非鳞状细胞癌，细胞均已发生恶性转化，蛋白的合成的速度均较快、合成的量均较多，故彼此之间无明显差异。因此，eIF-4A有望成为判断宫颈癌预后的分子标志之一。

[1] JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] WALBOOMERS J M, JACOBS M V, MANOS M M, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J]. J Pathol, 1999,189(1):12-19.

[3] LINDER P, LASKO P F, ASHBURNER M, et al. Birth of the D-E-A-D box[J]. Nature, 1989,337(623):121-122.

[4] EBERLE J, KRASAGAKIS K, ORFANOS C E. Translation initiation factor eIF-4A1 mRNA is consistently overexpressed in human melanoma cells in vitro[J]. Int J Cancer, 1997,71(3):396-401.

[5] SHUDA M, KONDOH N, TANAKA K, et al. Enhanced expression of translation factor mRNAs in hepatocellular carcinoma[J]. Anticancer Res, 2000,20(4):2489-2494.

[6] LIN Y W, APLAN P D. Gene expression profiling of precursor T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma identifies oncogenic pathways that are potential therapeutic targets[J]. Leukemia, 2007,21(6):1276-1284.

[7] WOLFE A L, SINGH K, ZHONG Y, et al. RNA G-quadruplexes cause eIF4A-dependent oncogene translation in cancer[J]. Nature, 2014,513(7516):65-70.

[8] SVITKIN Y V, PAUSE A, HAGHIGHAT A, et al. The requirement for eukaryotic initiation factor 4A (eIF4A) in translation is in direct proportion to the degree of mRNA 5′ secondary structure[J]. RNA, 2001,7(3):382-394.

[9] GALICIA-VAZQUEZ G, CENCIC R, ROBERT F, et al. A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AⅡ transcription[J]. RNA, 2012,18(7):1373-1384.

[10]刘薇,王言奎,杨慧英,等. 宫颈癌组织NDRG1与P16蛋白表达及其意义[J]. 齐鲁医学杂志, 2012,27(4):309-310,313.

(本文编辑 厉建强)

EXPRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF EIF-4A IN DIFFERENT CERVICAL TISSUES

SANGChangmei,MADehua,ZHUDezhang,SUIAihua,ZHAOShuping

(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the expression of eIF-4A in different cervical tissues and its clinical significance.MethodsEmploying quantitative real-time PCR and Western-blot analysis, the expression of eIF-4A mRNA in normal cervical tissue (N,n=30), low-grade cervical intraepithelial neoplasia (CINⅠ,n=26), high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CINⅡ-Ⅲ,n=25) and cervical cancer (CA,n=44) was detected.ResultsCompared with the group of normal cervical tissue, the expressions of eIF-4A mRNA and protein gradually increased in the order of groups CINⅠ, CINⅡ-Ⅲ and CA (F=11.07,14.17;P<0.05). In cervical cancer tissue, the expressions of eIF-4A mRNA and protein were correlated with the histological grade and lymphatic metastasis (F=20.03,19.77;t=7.99,5.38;P<0.05).ConclusionThe high expression of eIF-4A in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer indicates that eIF-4A plays a certain role in the oncogenesis of cervical cancer, and it may become one of prognostic biomarkers in cervical cancer.

eukaryotic initiation factor-4A; uterine cervical neoplasms; cervical intraepithelial neoplasia; prognosis

2015-02-11;

2015-05-27

桑昌美(1989-)，女，硕士研究生。

赵淑萍(1966-)，女，博士，主任医师，博士生导师。

R737.33

A

1008-0341(2015)04-0462-03