奥沙利铂并大剂量照射对大鼠直肠近期生物学效应

陈晓曼，安永恒，张碧媛，陈明璇

(青岛大学附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)



奥沙利铂并大剂量照射对大鼠直肠近期生物学效应

陈晓曼，安永恒，张碧媛，陈明璇

(青岛大学附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)

目的 了解奥沙利铂并大剂量X线盆腔照射对正常大鼠直肠组织的损伤。方法 将120只Wistar大鼠随机分成A、B、C、D组，D组给予腹腔注射生理盐水及假照,A组腹腔注射奥沙利铂15 mg/kg,B组盆腔给予6 MV X线12 Gy单次大剂量照射；C组腹腔注射奥沙利铂15 mg/kg联合6 MV X线12 Gy单次大剂量照射。照射后第3、7、14、21、42天，各组分别处死6只大鼠，观察直肠组织的形态学改变，免疫组织化学法检测Bax和Bcl-2蛋白表达情况。结果 C组大鼠照射后第7天直肠杯状细胞大量减少，固有层腺体萎缩，黏膜下可见大量的炎细胞浸润及纤维化形成；A、B组出现类似症状，程度较轻。A、B、C组各时间点的Bax表达阳性率比较差异均有显著性，其中第14、21、42天Bax表达阳性率较第3、7天降低，差异有显著性(F=129.1～550.8，P<0.01)。A、B、C组照射后的第3、7天Bax表达阳性率较D组明显升高，其中C组Bax表达阳性率均较同期的A、B组高，差异有显著性(F=596.9、134.8，P<0.01)。A、B、C组各时间点的Bcl-2表达阳性率比较差异均有显著性，3组第7天时表达率低于其他时间点(F=199.3～548.2，P<0.01)；C组Bcl-2表达阳性率较同期的A、B、D组低(F=25.9，P<0.01)。随着时间延长，C组Bcl-2表达阳性率呈一定的上升趋势，第14、21、42天均较第7天升高，差异有显著性(F=548.2，P<0.01)。结论 同期放化疗对直肠组织损伤较单纯化疗、单纯放疗严重，后期出现代偿性修复的机制可能与Bax、Bcl-2表达的变化有关。

辐射损伤；直肠；细胞凋亡；放化疗,辅助

同期放化疗可以明显提高肿瘤局部控制率、病人远期生存率，但与单一放疗或化疗相比，同期放化疗能造成放射区域组织的损伤加重，出现不同程度的并发症。尤其是在腹盆腔恶性肿瘤的放射治疗中，直肠常常受到照射，出现难以耐受的损伤。作为早反应组织之一，直肠对于分割剂量较为敏感，病人常因急性放射性直肠炎不能耐受而中断治疗，影响疗效。因此，预防放射性直肠炎的发生不容忽视。目前关于同期放化疗后正常直肠组织损伤的基础研究尚少。本实验通过动物实验，观察奥沙利铂联合单次大剂量照射盆腔后直肠组织形态学及相应指标变化，为同期放化疗直肠正常组织的保护提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雌性Wistar大鼠120只，清洁级，体质量为(250±20)g，由青岛市药检所提供。笼内饲养，自然光照，室温16～20 ℃，标准饲料喂养，自由饮水。随机分为A、B、C、D组，每组30只。

1.2 实验试剂及仪器

试剂：Bcl-2鼠抗人单克隆抗体、Bax兔抗人多克隆抗体等，购自青岛云山生物科技有限公司；苏木精、伊红、戊二醛等由青岛市市立医院病理科提供。仪器：美国瓦里安23EX直线加速器；自制大鼠固定器等。

1.3 实验方法

A组大鼠腹腔注射奥沙利铂15 mg/kg；B组大鼠给予6 MV X线12 Gy一次性照射大鼠盆腔；C组大鼠先给予腹腔注射奥沙利铂15 mg/kg，后给予6 MV X线 12 Gy一次性照射大鼠盆腔；D组腹腔注射等量生理盐水并行假照。需要放疗的大鼠腹膜腔内注射体积分数为0.10的水合氯醛麻醉，置于自制木板固定器上，模拟机下定位确定照射范围：上界为耻骨联合，下界为肛门口，左右界开放，射野面积 3 cm×4 cm，定位后将大鼠置于加速器下，应用6 MV X线 12 Gy一次性照射大鼠盆腔，源皮距为80 cm。各组大鼠分别在照射后的第3、7、14、28、42天深度麻醉处死，每次6只。

1.4 直肠组织形态学观察

剖取距肛门以上3 cm的直肠组织，肉眼观察大体形态。沿纵轴剪开，使用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)清洗干净，取大小约1 cm×1 cm组织，用甲醛溶液固定，常规脱水、透明、包埋，石蜡切片行苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察。由3位经验丰富的病理科医生共同评价大鼠直肠腺体的变化情况。评价标准：腺体正常，0分；腺体减少<25%，1分；腺体减少25%～49%，2 分；腺体减少50%～74%，3分；腺体减少75%～100%，4 分。

1.5 Bcl-2和Bax蛋白表达检测

采用S-P法[1]染色观察直肠组织中Bcl-2与Bax蛋白的表达。细胞质中出现黄色或棕黄色颗粒即为阳性。400倍光学显微镜下观察，每张切片随机选取10个高倍视野,每个视野计数200个细胞,共2 000个细胞,计算阳性细胞的百分数[2]。Bcl-2(Bax)表达阳性率=Bcl-2(Bax)阳性细胞数/计数细胞总数×100%。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组一般状况

A组大鼠较为活跃，进食量稍有下降，5 d后饮食量逐渐回升，未见稀便、黏液脓血便。B组大鼠照射后进食饮水量未见明显变化，3 d后进食量下降，少动，部分大鼠肛门口红肿充血，少量黏液便。C组大鼠照射后进食饮水量减少，甚至完全拒绝进食饮水，消瘦明显，反应迟钝，腹部凹陷，少量稀便、黏液便、脓血便，尿道口潮湿，肛门周围潮红、不洁；照射后28 d存活大鼠照射野脱毛，活动、进食饮水量减少。D组大鼠饮食排便正常，活动灵敏，毛色正常，体质量逐渐增加。

2.2 大鼠直肠组织病理学观察

光镜下观察可见，第7天时各实验组大鼠直肠组织病理学变化最为明显：C组大鼠直肠杯状细胞大量减少，固有层腺体萎缩，排列稀疏，黏膜下可见大量炎细胞浸润及纤维化形成；B组大鼠直肠黏膜及黏膜下组织轻度充血和少量炎细胞浸润，杯状细胞减少，肠管轻度扩张充血；A组大鼠直肠黏膜上皮和腺体结构基本完整，无明显细胞变性和炎细胞浸润。D组大鼠直肠黏膜结构完整，腺体排列整齐。

2.3 各组直肠腺体变化评分比较

第7天时A、B、C、D组大鼠直肠腺体变化评分分别为2.10±1.03、2.77±1.24、3.32±0.52、0，A、B、C组大鼠直肠腺体变化评分高于D组，C组高于A组，差异有显著性(F=17.579，P<0.05)；C组与B组比较差异无显著性(P>0.05)。

2.4 各组Bax表达比较

析因设计的方差分析结果显示，Bax表达组别与时间因素存在交互作用(F=122.6，P<0.01)。A、B、C组各时间点Bax表达阳性率比较差异均有显著性(F=129.1～550.8，P<0.01)。D组各时间点Bax表达阳性率差异无显著性(P>0.05)。A、B、C组照射后的第3、7天Bax表达阳性率较D组明显升高，第7天升高更为明显，差异有显著意义(F=188.6～596.9，P<0.01)，其中C组Bax表达阳性率较同期的A、B组高(q=15.0～64.9，P<0.01)。A、B、C组第14、21、42天Bax表达阳性率较第3、7天降低，差异有显著性(F=25.2～134.8，P<0.01)。见表2。

2.5 各组Bcl-2表达比较

析因设计的方差分析显示，Bcl-2表达组别与时间因素存在交互作用(F=118.5,P<0.01)。A、B、C组各时间点的Bcl-2表达阳性率比较差异均有显著性，其中第7天时表达率低于其他时间点(F=199.3～548.2，P<0.01)；各时间点D组的Bcl-2表达阳性率比较差异无显著性(P>0.05)。C组第7天时Bcl-2表达阳性率较A、B、D组低(F=25.9，q=4.6～14.5，P<0.01)。随着时间延长，C组Bcl-2表达阳性率呈一定的上升趋势，第14、21、42天表达阳性率均较第7天明显升高，差异有显著性(F=18.5～472.4，P<0.01)。见表3。

表2 各组不同时间点Bax蛋白表达阳性率比较

表3 各组不同时间点Bcl-2蛋白表达阳性率比较

3 讨 论

放疗同期联合化疗因能提高肿瘤控制率、提高治疗效果而成为目前治疗恶性肿瘤的常用方法。直肠癌位居我国肿瘤发病率第3位，术前同期放化疗可以降低肿瘤分期，提高直肠癌保肛率及局部肿瘤控制率[3]，已成为有适应证直肠癌的规范治疗方法。宫颈癌是女性发病率第2位的癌症，每年新发病例约50万，占所有新发癌症病例的5%[4]，铂类化疗联合放疗可以达到局部肿瘤降期、提高病人生存率的目的，是目前应用最广泛的综合性疗法。直肠的解剖位置固定，与腹盆腔脏器关系紧密，在治疗腹盆腔恶性肿瘤时通常不可避免地进入到射野区域内，受到X线的损伤[5]，发生急性放射性直肠炎。病人难以耐受，生活质量下降，甚至被迫中断治疗，严重影响了放射治疗的进程和疗效[6]。传统的放疗模式每次照射肿瘤的剂量为1.5～2.0 Gy，每天1次，每周5次，而大分割照射是通过增加单次放疗的分割剂量从而减少放疗分割次数，最终达到更为有效生物剂量，最大程度杀灭肿瘤细胞，同时减少放疗次数，使病人易于接受。与此同时，大分割放射线也造成了对直肠组织的损伤，急性放射性直肠炎通常始于放疗后1～2周，当直肠照射剂量>50 Gy时，放射性直肠炎的发生率明显提高[7]。直肠接受辐射后黏膜上皮可出现急性损伤，表现为充血水肿，腺体萎缩减少，肠黏膜通透性增加，破坏正常肠屏障免疫功能，造成细菌移位于肠内形成脓毒血症。李宜放等[8]研究显示，照射后正常直肠黏膜出现炎性改变，杯状细胞减少，肠上皮萎缩，黏膜及黏膜下炎性细胞渗出、嗜酸性粒细胞浸润,黏膜下层血管内皮可见大量充血水肿及纤维化。本研究光镜下显示，与其他组比较，同期放化疗组大鼠在第7天时直肠黏膜上皮细胞水肿较明显，腺上皮杯状细胞数目减少，炎性细胞浸润较多，固有层腺体萎缩明显，腺体减少严重，黏膜下可见大量炎细胞浸润及纤维化形成明显，与相关研究结果相符。提示同期放化疗后发生急性放射性直肠炎的程度较为严重，对直肠的损伤较重。

已有研究表明，奥沙利铂对结直肠癌细胞株及顺铂耐药的细胞株有显著抑制作用，且临床用药不良反应较轻[9]。在直肠癌治疗中应用奥沙利铂有放疗增敏作用。放化疗引起细胞损伤的作用机制主要是通过碱基破坏、单链断裂及双链断裂引起的细胞DNA损伤而实现，从而激活细胞凋亡。调节细胞凋亡过程关键是Caspase家族级联激活而引发的细胞崩解。其中，Bcl-2家族是对Caspase家族的级联激活进行调控的一类重要因子[10]。凋亡抑制基因bcl-2与凋亡诱导基因bax的比率(bcl-2/bax)是调控细胞凋亡的关键。当其比值升高，抑制细胞凋亡；比值下降，促进细胞凋亡。正常直肠组织中Bcl-2蛋白主要表达于陷窝基底部，表皮上皮细胞表达较少；Bax蛋白主要在直肠黏膜上皮的胞浆及胞膜中表达，基底细胞表达较少。这种表达分布对于维持陷窝基底细胞的增殖、表皮细胞的死亡脱落、正常黏膜的新陈代谢功能有重要意义。本研究结果表明，在接受照射后的一段时间内，同期放化疗组正常直肠组织的损伤程度较单纯放疗组及单纯化疗组严重，其机制可能与同期放化疗引起的细胞损伤诱发细胞凋亡，直肠组织细胞中Bax蛋白表达阳性率逐渐升高，Bcl-2蛋白表达阳性率逐渐降低有关；随着时间延长，Bax蛋白表达阳性率开始下降，Bcl-2蛋白表达阳性率逐渐升高，其机制可能与细胞损伤后发生代偿性修复，使凋亡蛋白表达减少，抗凋亡蛋白表达升高，抑制凋亡有关。

综上所述，奥沙利铂联合大剂量放疗后大鼠正常直肠组织初始急性损伤较单纯放疗组及单纯化疗组严重，可能与同步放化疗后凋亡相关蛋白的变化有关。后期出现代偿性修复，提示对于临床上身体潜力大、无糖尿病等的病人可以考虑选择同期放化疗。但要进一步明确直肠组织损伤发展变化过程与细胞凋亡相关蛋白表达的关系以及临床效果，还需进一步的基础研究和临床验证。

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(本文编辑 黄建乡)

SHORT-TERM BIOLOGICAL EFFECT OF OXALIPLATIN COMBINED WITH A SINGLE LARGE-DOSE RADIATION ON RECTUM OF RATS

CHENXiaoman,ANYongheng,ZHANGBiyuan,CHENMingxuan

(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the damage of normal rectum in rats caused by oxaliplatin combined with a single large-dose of radiation.MethodsA total of 120Wistarrats were equally randomized to four groups as groups A, B, C and D. The rats in group D were intraperitoneal injection of normal saline and pseudo radiation; those in group A were intraperitoneal injection of oxaliplation (15 mg/kg); those in group B were given 6 MV X-ray at single dose of 12 Gy irradiating on pelvic cavity; and those in group C received 6 MV X-ray at a single dose of 12 Gy irradiating pelvic cavity after intraperitoneal injection of 15 mg/kg oxaliplation. Six rats in each group were killed in each time on days 3,7,14,21 and 42 after radiation. Morphological changes were observed by HE staining. Expressions of Bcl-2 and Bax were examined using immunohistochemical technique.ResultsOn day 7 after radiation, the goblet cells in rectum of rats in group C markedly decreased, glands in lamina propria atrophied, and a large quantity of submucosal inflammatory cellular infiltration and fibrosis could be seen, similar reactions were also observed in groups A and B, but slighter. Expressions of Bax were significantly different between each time point of groups A, B and C, of which, the expressions on days 14, 21 and 42 were lower than that on days 3 and 7 (F=129.1-550.8,P<0.01). On days 3 and 7 after radiation, the expression of Bax in groups A, B and C was elevated compared with group D, of which, the expression of Bax in group C was higher than that in groups A and B of corresponding time (F=596.9，134.8;P<0.01). The difference of expression of Bcl-2 in groups A, B and C between different time points was significant, the expression rate of the three groups on day 7 was lower than the other time points (F=199.3-548.2,P<0.01). The positive expression rate of Bcl-2 in group C was lower than groups A, B and D of the same time period (F=25.9,P<0.01). Along with the extension of time, there was a tendency of unvarying elevation of Bcl-2 expression, being higher on days 14,21 and 42 than that on day 7 (F=548.2,P<0.01).ConclusionConcurrent chemoradiotherapy may cause more severe damage than merely radio-or chemotherapy do in rectal tissue of rats. The presence of compensatory and repair in later stage is probably associated with the changes of expressions of Bax and Bcl-2.

radiation injuries; rectum; apoptosis; chemoradiotherapy, adjuvant

2015-01-20;

2015-05-05

陈晓曼(1987-)，女，硕士研究生。

安永恒(1961-)，男，主任医师，教授，硕士生导师。

R818.8

A

1008-0341(2015)04-0386-04