肝螺杆菌对肝癌细胞侵袭能力的影响及其可能分子机制

张春忙 彭凡洲 邓慧敏 王 菲 刘 江 白 杨

1994年，在国际癌症研究中心（International A－gency for Research on Cancer,IARC）公布的人类致癌物名单中，幽门螺杆菌被确定为人类Ⅰ类致癌因子[1]。人类首次将细菌感染与癌症的发生联系在一起。我国是肝癌高发区，在肝癌的病因研究方面，目前认为HBV和HCV感染是原发性肝癌最常见的病因，其次还与黄曲霉素、酒精、自身免疫等因素有关[2]。大量临床研究表明，尽管存在的致癌因素相似，但是其临床表现及预后却相差甚远。因此，疾病表现除了与致癌因素和宿主免疫状况密切相关外，可能还存在其他协同致病因素，如细菌感染等[3]，近年来这逐渐成为人们关注的焦点[4]。大量动物实验研究已证实，肝螺杆菌（Helicobacter Hepaticus,H.hepaticus）感染与啮齿类动物肝癌的发生有显著的相关性[5-7]，国内外学者在人类肝癌组织中发现H.hepaticus 16sRNA也有不少报道[8]，但目前针对H.hepaticus与肝癌细胞的直接作用及其可能机制研究相对较少。因此，在离体条件下，研究H.hepaticus能否作用于肝癌细胞，这将有助于进一步认识H.hepaticus感染与肝癌发生发展的关系。

本研究旨在探讨H.hepaticus对肝脏肿瘤细胞本身的直接作用及H.hepaticus活菌对肝癌细胞侵袭能力的影响及其可能机制。

材料和方法

一、实验材料

肝癌细胞株HEPG2和HCCLM3，南方医院消化内科实验室冻存。H.hepaticus标准菌株ATCC51450，购自美国国家标准菌种保藏中心（American Type Culture Collection,ATCC）。南美胎牛血清（FBS），购自美国Hyclone公司。DMEM高糖培养基，均购自美国Gibco公司。兔抗人TLR4和MyD88、TRIF多克隆抗体，购自美国Abcam公司。鼠抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠（兔）二抗，购自北京中杉金桥生物公司。

二、方法

1.细菌培养

将冻存的H.hepaticus标准菌株于含8%灭活脱纤维羊血的布氏琼脂培养基复苏，37℃、微需氧（5%O2，10%CO2，85%N2）、高湿度条件下培养 5 ～ 7 d，根据菌落性状、形态学特征及生化反应鉴定为H.hepaticus后，纯培养2～3代，应用PBS收集细菌，4℃3 000 rpm离心10 min，弃上清，应用PBS重新悬浮，于分光光度计上调节H.hepaticus浓度为1×109CFU/mL备用，并将H.hepaticus菌液连续3次作10倍稀释（1×108CFU/mL、1×107CFU/mL和1×106CFU/mL）。

2.细胞与细菌共孵育

将人肝癌细胞株HEPG2和HCCLM3接种于盛有双抗的含10%胎牛血清的DMEM培养基的培养瓶，置37℃、含5%CO2、饱和湿度的环境中培养，每隔2 d弃去旧液，换以新鲜培养基，待培养至细胞融合为单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按预试验结果配制成1×106/mL细胞浓度，以每孔1 mL接种于6孔培养板中，放入细胞培养箱中培养。细胞贴壁后，吸去原培养液，PBS洗涤，更换无血清的DMEM培养基。实验组加入1×109CFU/mL、1×108CFU/mL、1×107CFU/mL 和 1×106CFU/mL四个不同浓度的H.hepaticus活菌刺激肝癌细胞，每组分别取12 h、24 h、48 h、72 h 4个时间点。对照组仅加入无H.hepaticus的空白液体培养基。

3.体外侵袭试验

将H.hepaticus处理的实验组细胞用PBS洗涤2次，0.25%胰酶消化细胞，l 100 rpm离心5 min，弃上清，DMEM培养基（含1%FBS）重悬细胞，细胞计数，调整HEPG2及HCCLM3细胞密度至1×106/mL。Transwell小室下室加入500 μL含10%FBS的DMEM培养基作为趋化因子，接种细胞，细胞悬液200 μL加入Transwell小室上室，然后盖好盖子，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，通过给细胞0.1%结晶紫室温染色20 min，可在光学纤维镜下计数细胞，选择中及上、下、左、右共5个象限计数。

4.蛋白质免疫印迹分析（Western blot）

用1×108CFU/mL的H.hepaticus刺激HEPG2和HCCLM3细胞48 h后，采用RIPA裂解液提取细胞蛋白，4℃13 000 g离心20 min后，收集上清液，BCA法进行蛋白含量测定。用移液枪吸取所需上样样品至EP管中，加入5×loading buffer稀释至1×的终浓度。上样前要将样品加热5 min使蛋白变性，将40 μg该蛋白质加载到10%的SDS-PAGE中电泳，经浓缩胶（80 V、30 min），分离胶（120 V、90 min）分离后，电转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜放在含有5%脱脂奶粉封闭液中，置于摇床上室温孵育1 h后用TBST缓冲液洗膜，分别加入相应的封闭液稀释的一抗（兔抗人TLR4，MyD88及TRIF多克隆抗体和鼠抗人GAPDH单克隆抗体（稀释浓度均为1:1 000）），置于4℃摇床孵育过夜，再用0.01 mol/L TBST缓冲液洗膜，加入合适的酶标二抗 （辣根过氧化物酶偶联的二抗溶液山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG），TBST洗膜，置于室温下摇床缓慢振荡。化学发光剂（ECL）检测转印膜上靶蛋白信号。

5.荧光定量 PCR（real time PCR）

用1×108CFU/mL的H.hepaticus刺激HEPG2和HCCLM3细胞48 h后，采用RNAiso Plus提取细胞的总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度。取2 μg RNA作为模板，根据Strand cDNA Synthesis Kit说明书反转录为cDNA，取cDNA进行PCR扩增，根据SYBRPremix Ex Taq II说明书进行Real time PCR，25 μL的PCR反应体系。PCR程序：95℃30 s，预变性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 个循环。本研究中所使用的引物由上海生工生物工程公司合成（表 1）。

表1 检测基因引物序列

6.RNA干扰

根据siRNA oligomer和lipofectamineTM 2000说明书，建立siRNA干扰系统，诱导TLR4、MYD88基因沉默，下调HEPG2和HCCLM3细胞中TLR4和MyD88基因的表达，使用Western Blot检测TLR4、MyD88表达水平，验证siRNA干扰的效果。分别设置TLR4-siRNA、MyD88-siRNA干扰组、阴性对照组（转染无关序列）和空白对照组（空白转染），用H.hepaticus作用为各组细胞，通过Transwell实验检测各组细胞侵袭能力是否有变化。小干扰RNA（siRNA）的寡核苷酸序列（阴性对照ctrlsiRNA：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-3′；MyD88-siRNA：5′-AAG GCA AUG AAG AAA GAG UU C-3；TLR4-siRNA：5′-AAC TTG TAT TCA AGG TCT GGC-3′）。

三、统计学处理

结 果

一、H.hepaticus增加人肝癌细胞的侵袭能力

通过Transwell实验，用 1× 109CFU/mL、1×108CFU/mL、1×107CFU/mL、1×106CFU/mL不同浓度的H.hepaticus刺激肝癌细胞后，在12 h、24 h、48 h、72 h时间点检测侵袭细胞数量，以此观察浓度不同、刺激时间不同情况下H.hepaticus对肝癌细胞的侵袭能力的影响。并依此为根据，确定后续实验的最佳刺激浓度及刺激时间。实验结果表明，如图1所示，随着H.hepaticus活菌刺激浓度的增加，穿过基质膜的侵袭性细胞的数量明显增加，且在1×108CFU/mL达到峰值。如图2所示，我们发现相同浓度刺激时，随着时间的延长，穿过基质膜的侵袭性细胞的数量明显增加，且在刺激48 h时达到峰值。基于该实验结果，我们后续实验H.hepaticus刺激浓度选为1×108CFU/mL，刺激时间选为48 h。我们的数据显示H.hepaticus可促进肝癌细胞的侵袭能力，且呈时间及浓度依懒性，在一定范围内，随着H.hepaticus刺激浓度及时间的延长，促进肝癌细胞的侵袭能力越强。

图1 HEPG2或HCCLM3细胞经不同浓度H.hepaticus刺激

图2 HEPG2或HCCLM3经不同时间的H.hepaticus刺激

二、H.hepaticus激活肝癌细胞内的 TLR4/MyD88信号通路

图3 HEPG2和HCCLM3细胞经或不经H.hepaticus剌激TLR4、MyD88、TRIF 蛋白表达水平

我们用Western Blot的方法检测经过H.hepaticus刺激48 h后，人肝癌细胞HEPG2和HCCLM3细胞中TLR4、MyD88和TRIF的表达情况。如图3，结果显示，经H.hepaticus刺激后，肝癌细胞HEPG2和HCCLM3中TLR4、MyD88蛋白水平明显上调（P<0.05），但对TRIF的表达没有明显影响 （P>0.05）。我们用利Real time PCR的方法对此进行了进一步的验证，如图4，mRNA水平也证明了相似的结果。结果说明，H.hepaticus可能通过MyD88介导TLR4的信号通路转导来激活TLR4信号通路，而不是通过TRIF介导。

图4 HEPG2和HCCLM3细胞经或不经H.hepaticus剌激TLR4、MyD88、TRIF 基因表达水平（*P<0.05；**P>0.05）

三、H.hepaticus通过影响TLR4/MyD88信号通路增强人肝癌细胞的侵袭能力

为进一步证实TLR4/MyD88信号通路与H.hepaticus增强人肝癌细胞侵袭能力的关系，我们通过小RNA干扰方法下调肝癌细胞HEPG2和HCCLM3中TLR4和MyD88的蛋白表达水平（图5），经H.hepaticus刺激后用Transwell实验检测各组肝癌细胞的侵袭能力。如图6，与正常对照组相比，TLR4或MyD88基因沉默后，H.hepaticus刺激不能提高肝癌细胞的侵袭能力，此时肝癌细胞的侵袭能力下降（P<0.05），结果说明H.hepaticus增强人肝癌细胞的侵袭能力是依赖TLR4/MyD88信号通路而实现的。

图6 HEPG2和HCCLM3细胞转染了靶向TLR4-siRNA、MyD88-siRNA和对照siRNA后，经H.hepaticus刺激，siRNA下调TLR4、MyD88表达水平后的细胞的侵袭能力明显下降，Control为未转染对照，*P<0.05。

图5 HEPG2和HCCLM3细胞转染了靶向TLR4-siRNA、MyD88 siRNA和对照siRNA后，TLR4、MyD88的蛋白表达水平（Control为未转染对照）

讨 论

流行病学研究表明，螺杆菌感染与肝癌发病率呈正相关，这提示螺杆菌可能在肝癌的发生发展中具有重要作用[2]。大量动物实验资料显示，H.hepaticus感染和肝脏炎症及肿瘤的发生具有明显相关性，国内外许多学者利用PCR、DNA序列分析证实了人肝癌组织中确实存在H.hepaticus感染，但至今细菌培养技术仍未成功从人体标本中分离出活菌，H.hepaticus是否具有致癌作用仍难以证明[8]。本课题组前期研究显示，感染HBV和HVC的肝癌患者血清抗H.hepaticus IgG浓度与病毒DNA量及AFP浓度呈正比，提出了H.hepaticus感染可能作为单独或辅助因素促进肝脏肿瘤发生发展。以往研究H.hepaticus主要集中在动物实验及组织水平探讨上，H.hepaticus对肝脏肿瘤细胞本身的影响鲜有报道。本研究旨在阐述H.hepaticus对肿瘤细胞本身的直接作用，研究H.hepaticus活菌对肝癌细胞侵袭能力的影响。

早期肝癌患者并没有特异性的临床症状及体征，因此临床上就诊的肝癌患者大多数已发展为晚期肝癌，甚至出现远处转移，通常已经错过最佳的手术时机。肝癌患者预后的影响因素很多，其中最重要的两个原因为侵袭和转移。肿瘤导致患者死亡的主要原因之一，是在肿瘤发生发展过程中出现的远处转移及其引发的相关并发症。深入研究肝脏肿瘤的浸润及转移机制，将有助于开发针对浸润及转移的分子的基因靶向治疗，具有重要的临床意义[9-11]。

Toll样受体是一类天然免疫受体，属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，最早在果蝇中发现。此类受体与固有免疫密切相关，能够识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs），是近年来发现的一类重要的模式识别受体（pattern recognitionreceptor,PRR）。随着对TLRs深一步的研究，发现TLRs的分布十分广泛，主要表达于天然免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、多形核细胞、淋巴细胞及自然杀伤细胞等表面，它能激活免疫细胞分泌大量炎性细胞因子和趋化因子，在发挥机体抗病原微生物感染能力中起关键作用[12]。TLRs在很多肿瘤细胞及组织中都有功能性表达，大量研究认为TLRs参与肿瘤细胞的生物学行为改变，并在肿瘤发生发展过程中起着重要作用[13]，特别是与炎症相关肿瘤，如肝癌、结肠癌、胃癌等[14-16]。TLRs是进化过程中比较保守的一个受体家族，至今包括13个成员陆续被发现，它在天然免疫和获得性免疫中都承担着相当重要的角色，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。

TLR4是人类发现的第一个Toll样受体，几乎分布于所有的细胞系。最初人们认为TLR4主要表达于免疫细胞特别是巨噬细胞和树突状细胞表面，一旦识别并结合PAMPs，将激活天然免疫细胞，就会导致下游信号事件和转录因子的激活，最终诱导分泌一系列抗微生物分子、化学趋化因子、细胞因子和共刺激分子，参与机体的抗感染免疫。研究证实，在TLR4信号通路中，存在MyD88依赖途径和TRIF依赖途径的2条信号通路。在MyD88依赖的通路中，MyD88依赖途径需要由MyD88承接转导，是几乎所有TLRs信号转导的共同通路 （TRL3除外），而TRIF依赖途径，即是MyD88非依赖途径，由β干扰素TIR结构域衔接蛋白 （TIR-domaincontaining adaptor inducinginterferon-β,TRIF）联接，主要存在于TLR3和TLR4通路中。近年来发现，TLR4也广泛表达于在多种肿瘤细胞和组织中，并与肿瘤的分化程度及预后密切相关（如肺癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌等）[17-20]。目前在对消化系统疾病研究过程中，研究发现TLR4在一些慢性肝脏疾病如病毒性肝炎、肝硬化、肝纤维化、肝癌及酒精性肝病的发生发展过程中具有重要作用[21]。

在本研究中，我们首先用Transwell侵袭实验，发现肝癌细胞HEPG2和HCCLM3在不同浓度、不同时间接受H.hepaticus刺激后，侵袭细胞数量显著增加，且呈时间及浓度依懒性，且在1×108CFU/mL刺激48 h到达峰值。为了探讨H.hepaticus提高肝癌细胞侵袭能力的可能分子机制，我们检测H.hepaticus刺激是否可激活肝癌细胞中的TLR4信号，结果表明，经处理后HEPG2和HCCLM3细胞TLR4蛋白和mRNA表达水平明显升高，且H.hepaticus可有效上调TLR4信号接头蛋白MyD88的表达，却对TRIF的表达没有明显影响。这些结果提示，H.hepaticus可有效活化肝细胞癌中的TLR4/MyD88信号通路。我们后续进一步研究H.hepaticus促进肝癌细胞侵袭能力的增强是否由TLR4/MyD88信号所介导，我们采用siRNA技术下调肝癌细胞中TLR4和MyD88的表达水平，结果显示，将HEPG2细胞和HCCLM3细胞分别转染TLR4和MyD88的siRNA后，可显著下调其TLR4和MyD88蛋白水平的表达。siRNA转染能够有效抑制H.hepaticus对HEPG2细胞和HCCLM3侵袭能力的增强作用，说明TLR4/MyD88信号在H.hepaticus促进肝细胞癌的侵袭中具有重要作用。

H.hepaticus感染与肝癌的发生发展具有重要的研究价值，尤其是对H.hepaticus的致病机制以及对肝癌病原学方面的病因的探索具有重要意义。目前对于H.hepaticus致病机制的研究尚处于初级阶段，H.hepaticus对肝癌细胞侵袭力及其他生物学功能的影响有待进一步深入研究，H.hepaticus对肝癌细胞TLRs信号通路及其他相关通路的影响也有待进一步阐明。

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