稳定表达miR-17-5p的PC12细胞株构建及鉴定

张皓云, 王鲁娟, 王凤斌, 刘红兵, 苏文霞

(1. 潍坊医学院 基础医学概论教研室, 山东 潍坊 261053; 2. 潍坊医学院 诊断学教研室, 山东 潍坊 261053;3. 潍坊医学院 生理学教研室, 山东 潍坊 261053)

张皓云1, 王鲁娟2, 王凤斌3, 刘红兵3, 苏文霞3

(1. 潍坊医学院 基础医学概论教研室, 山东 潍坊 261053; 2. 潍坊医学院 诊断学教研室, 山东 潍坊 261053;3. 潍坊医学院 生理学教研室, 山东 潍坊 261053)

目的:构建稳定表达miR-17-5p 的PC12细胞株。方法:将质粒PEGFP-N1-vector空载体和PEGFP-N1-miR-17-5p表达载体扩增、抽提,利用脂质体转染技术将质粒转染PC12细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GFP表达,Real-time PCR检测转染PC12细胞 miR-17-5p的表达。结果:荧光显微镜观察到空载组和miR-17-5p组细胞都有绿色荧光蛋白高表达,Real-time PCR检测稳定转染miR 17-5p后PC12细胞内miR-17-5p的表达较空载组明显升高(P<0.01)。 结论:miR-17-5p在PC12细胞稳定表达,为进一步研究miR-17-5p对神经细胞的调制作用提供有用的细胞模型。

微小RNA； miR-17-5p； PC12细胞

微小RNA(microRNAs, miRNAs)是细胞分化、生长、增殖、衰老以及凋亡的重要调节因子[1],在脑组织中可调节多种基因的表达,广泛参与神经元发育、细胞成熟和迁移、突触可塑性等多种生理过程,是学习和记忆过程中重要的调控因子。越来越多的研究表明，miRNA的功能异常可能参与了阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的发生。miR-17-5p是miR-17-92基因簇的一员,已有多篇文献报道miR-17-5p可能通过调控细胞周期、凋亡、炎症反应和免疫应答等参与肿瘤的发生、侵入和转移等[2-3]。目前,有研究显示miR-17-5p在神经组织有特异性表达,但其对神经细胞结构和功能的调节作用研究较少,为此我们构建稳定表达miR-17-5p的PC12细胞株,为研究miR-17-5p在神经细胞的调制作用构建良好的细胞模型。

1 实验材料与试剂

PC12细胞(中国科学院上海生命科学研究院)；质粒PEGFP-N1-vector空载体(vector)和PEGFP-N1-miR-17-5p(miR-17-5p)表达载体(加拿大多伦多大学杨伯华教授馈赠)；XL-1-blue感受态菌(潍坊医学院分子免疫实验室保存)；RPMI-1640培养基(HyClone,赛默飞世尔科技有限公司)、胰蛋白酶(杭州四季青生物材料工程有限公司)；胎牛血清(上海依科赛生物制品有限公司)；D0018质粒中量抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Lipofectamine 2000(invitrogen公司)；Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quatitation Assay试剂盒(上海吉玛公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

PC12细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,37℃、5%的CO2的培养箱中培养,每隔48 h换液,待单层培养细胞生长至80%～90%融合后传代,选取对数生长期细胞进行实验。

2.2 质粒的扩增、抽提

(1) 质粒的扩增。将纸片上的质粒vector(526 μg/mL)和miR-17-5p (266 μg/mL)剪下,加入TE缓冲液(pH8.8)100 μL,4 ℃静置约2 h,离心1 min,留上清液备用:取100 μL的XL-1-blue感受态菌,再加入20 μL质粒上清液混均；冰浴30 min左右；42 ℃热击90 s；置于冰上5 min,加入LB培养基600 μL；37 ℃摇床1 h；离心2 min,弃上清液450 μL,保留沉淀物150 μL备用,接种到已备好的卡那抗性培养基上；第2天挑出单个菌落加入5 mL卡那LB； 37 ℃摇床过夜。

(2) 质粒抽提。采用碧云天D0018中量抽提试剂盒按说明书,抽提质粒miR-17-5p。用紫外-可见光分光光度计(NanoDrop 2000c,赛默飞世尔科技有限公司)检测质粒浓度。

2.3 细胞株的构建

(1) 细胞准备。选取对数生长期的PC12细胞并接种于6孔细胞培养板中,待细胞长至90%～95%混合时,吸出完全培养基,用RPMI-1640(不含血清)冲洗2～3次,加入适量RPMI-1640(不含血清)。

(2) 细胞转染与筛选。利用Lipofectamine 2000脂质体,将抽提所得vector、miR-17-5p质粒转染到PC12细胞中,G418(600 μg/mL)筛选2周,挑取GFP阳性单克隆细胞,以300 μg/mL G418完全培养基进行扩增培养,备用。荧光倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化。

2.4 荧光显微镜观察转染的绿色荧光蛋白的表达

将稳定转染后细胞传代,接种入放有10%的多聚赖氨酸处理后盖玻片的24孔板中,待细胞贴壁培养24 h后取出, PBS漂洗3次,4%的多聚甲醛4 ℃固定30 min,取出细胞爬片,封片,荧光显微镜下观察细胞形态和绿色荧光蛋白的表达。

2.5 Real-time PCR检测 miR-17-5p的表达

细胞总 RNA 提取按Trizol说明书进行,经紫外-可见光分光光度计检测,A260∶A280值为1.8～2.0(A为吸光度)的用于cDNA合成。采用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quatitation Assay试剂盒(上海吉玛公司产品)进行 RNA 反转录、miR-17-5p real-time PCR 扩增,具体操作按照说明书进行。U6 为内参照基因。反应条件:95 ℃、3 min；95 ℃、12 s,62 ℃、60 s 40个循环。根据相对定量法计算目的片段扩增比例,各样本重复3 次。所得数据用 2-ΔΔCt评定各组稳转细胞株内 miR-17-5p相对表达量。

2.6 数据统计分析

3 结果

3.1 vector、miR-17-5p转染PC12细胞及G418抗性克隆的筛选

用Lipofectamine 2000脂质体包裹质粒vector、miR-17-5p后对PC12细胞进行转染, 600 μg/mL G418进行抗性克隆的筛选。G418的培养液中培养至14 d,未转染细胞无G418抗性，不能贴壁生长,转染后细胞有细胞克隆生长。

3.2 荧光显微镜观察转染的绿色荧光蛋白的表达

2组细胞在荧光显微镜下均可见到强弱不等的绿色荧光(见图1),vector组细胞绿色荧光表达亮度高,分裂增殖能力强,细胞密度高、轮廓清楚；miR-17-5p组细胞较vector组绿色荧光表达稍弱,分裂增殖能力差，细胞密度低、部分细胞轮廓不清楚。

图1 Fluorescent microscopy of vector and miR-17-5p stable transfected PC12 cells (× 100).

3.3 Real-time PCR检测稳定转染后各组细胞内 miR-17-5p的表达

PC12细胞稳定转染 miR-17-5p表达载体后,细胞内 miR-17-5p的表达较vector空载组明显升高(P<0. 01),见图2。

图2 The expression of miR-17-5p in stable transfected PC12 cells. Each bar represents the mean±S.E.M. of four independent experiments. **P<0.01, compared with vector.

4 讨论

miRNAs是一类长度为20～25个核苷酸分子组成的内源性非编码小分子RNA,通过与靶mRNA分子3’端非编码区域( 3’ -untranslated region,3’-UTR) 的完全或不完全配对,降解靶基因mRNA或抑制蛋白合成,从而调节靶基因参与的信号通路,实现对细胞增殖、凋亡、分化、新陈代谢等的调节。研究证明，人类60% 以上的蛋白编码基因表达受到miRNA 调控[4]。脑组织中富含miRNA,相对于其他器官表达的miRNA种类更多,表达水平也更高,在正常的神经系统中,miRNA参与了不同生理过程、不同信号传导通路的基因表达调控,如神经系统的发育、神经元增殖、凋亡、突触可塑性、树突棘形成、神经保护及诱导神经干细胞分化等[5-7],miRNA与大脑的学习与记忆功能以及神经变性性疾病等都密切相关[8]。随着年龄的老化及细胞分裂的进行,机体miRNA的合成、代谢及功能也有可能会发生一系列的变化,而对这一过程的深入了解将有助于miRNA在AD等神经退行性疾病发生、发展的探讨。

AD是一种以进行性认知功能障碍、记忆损害为主要表现的中枢神经系统退行性疾病。研究发现AD的发生机制可能与β淀粉样蛋白 (β-amyloid protein,Aβ)沉积、Tau蛋白磷酸化、免疫炎症等病理过程有关。miRNA能通过介导这些病理过程而参与AD的发生[9-10]。APP基因的点突变、代谢异常及过表达引起的Aβ聚集,APP也是miRNA靶向调控分子之一,据数据库预测分析,APP mRNA 3’UTR 区存在多个miRNA的潜在结合位点,筛选与AD相关的miRNAs及其靶基因和相应的蛋白表达,有望成为研究AD发病机制和治疗的新途径。

研究显示，miR-17-5p在脑组织有特异性表达,参与调控神经元APP基因表达的过程,在胶质细胞瘤的研究中发现miR-17-5p通过抑制murine double minute 2 (MDM2)基因的表达,抑制肿瘤细胞的增殖和降低耐药性[11-13]。PC12细胞株源自神经嵴细胞,经神经生长因子诱导处理后,可分化成交感神经元样细胞,这种分化使其在形态、生理、生化功能方面更接近于神经元。我们利用转基因技术,成功建立了在PC12细胞内过表达miR-17-5p的细胞模型,荧光显微镜下观察发现miR-17-5p组PC12细胞生长缓慢、细胞密度低,提示miR-17-5p对细胞的分裂、增殖可能有抑制作用。

我们将深入研究和探讨miR-17-5p对神经细胞的调制作用及其机制,从新的角度来研究AD的发病机制,从而为其治疗提供新的靶点。

References)

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Establishment and appraisal of miR-17-5p stably transfected PC12 cell line

Zhang Haoyun1, Wang Lujuan2, Wang Fengbin3, Liu Hongbing3, Sun Wenxia3

(1. Department of preclinical medicine, Weifang Medical College, Weifang 261053, China; 2. Department of diagnostics, Weifang Medical College, Weifang 261053, China; 3. Department of Physiology, Weifang Medical College, Weifang 261053, China)

Objective: To establish stable expressing miR-17-5p PC12 cell line.Methods: Amplification and extraction of PEGFP-N1-vector and PEGFP-N1-miR-17-5p plasmids. Then the plasmids were transfected into PC12 cells by Lipofectamine 2000. Fluorescence microscope and real-time PCR were employed to detect the expression alterations of GFP and miR-17-5p in stable transfected PC12 cells. Results: High expressions of GFP were observed both in vector group and miR-17-5p group. Real-time PCR show that the expression of miR-17-5p is significantly elevated in PEGFP-N1-miR-17-5p stable transfected PC12 cells compared with the PEGFP-N1-vector stable transfected cells (P<0.01). Conclusion: Stable transfection of miR-17-5p PC12 cell line is established which will provide a useful tool to study the role of miR-17-5p in neurons.

microRNA; miR-17-5p; PC12 cell

2015- 05- 11 修改日期：2015- 06- 23

山东省自然科学基金资助项目(ZL2013HL065);山东省高等学校科技计划项目(J15LK10)

张皓云(1974—)，女，北京，博士，讲师，研究方向为神经退行性疾病机制及其防治研究.

E-mail：haoyunzh@163.com

R33-33,Q4-33

B

1002-4956(2015)12- 0066- 03