RECK、MMP-14及VEGF在喉癌组织中的表达及临床意义*

河北大学附属医院耳鼻喉科 (保定071000)

张 驰 杜锦朵 赵 雷 冉 程

RECK、MMP-14及VEGF在喉癌组织中的表达及临床意义*

河北大学附属医院耳鼻喉科 (保定071000)

张 驰 杜锦朵 赵 雷 冉 程

目的：探讨逆转录诱导蛋白基因(RECK)、基质金属蛋白酶-14(MMP-14)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)在喉癌组织中的表达及其临床意义。方法：应用免疫组织化学检验法(S-P法)检测74例喉癌患者、45例癌旁组织和40例正常粘膜组织中的RECK、MMP-14以及VEGF的阳性表达率，并探讨其临床意义。结果：喉癌组织中RECK蛋白表达量低于癌旁组织和正常组织，癌组织中表达与癌旁组织表达比较有统计学意义；癌旁组织和正常组织相比无统计学意义；MMP-14在喉癌组织中的阳性率高于癌旁组织和正常粘膜组织，前两者相比有统计学意义，后两者相比无统计学意义；VEGF在正常粘膜组织中无表达，在喉癌组织中的阳性率高于癌旁组织和正常粘膜组织，前两者相比有统计学意义，后两者相比无统计学意义。结论：RECK、MMP-14在喉癌组织、癌旁组织和正常粘膜组织均有表达；RECK在喉癌发生发展中不起关键作用；MMP-14的表达可能与喉癌的发生、侵袭和转移有关；VEGF在正常粘膜组织中无表达， 蛋白表达水平随肿瘤分化程度而异，与临床分期的早晚和淋巴结的转移呈正相关。

喉癌在我国北方地区发病率较高，93%～99%为鳞状细胞癌。RECK是伴有Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白，是一种新型基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂和肿瘤抑制基因，可在转录后水平抑制多种MMPs的表达，对抑制肿瘤的侵袭、生长、转移和血管生成有一定的作用。MMP-14是一种特殊蛋白酶，属于基质金属蛋白酶家族，是一类以细胞外基质蛋白为主要底物的一组锌依赖性肽链内切酶的总称。不但介导肿瘤细胞对宿主，包括基底膜在内的细胞外基质(ECM)的降解，还具有促进肿瘤细胞新血管形成，影响和调控着肿瘤细胞的生长的作用。VEGF为血管内皮生长因子，在新生血管的发生发展过程中起重要作用。有研究表明，它也是肿瘤血管形成的特殊因子。在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌等肿瘤细胞中均发现过VEGF的表达[1]。本研究通过研究RECK、MMP-14和VEGF在喉癌组织、癌旁组织和正常组织的表达情况，探讨其与喉癌发生发展的关系。

材料与方法

1 一般资料 收集自2011年6月至2013年6月之间收治的喉癌患者74例，取其癌部组织74份、癌旁组织45份和40例非喉癌患者正常粘膜组织作对照。喉癌患者74例中，男性50例，女性24例，年龄42～73岁，平均年龄55±2.5岁,中位年龄59岁；所有患者均经CT、MRI或PET-CT检查，病理组织活检切片均确诊为鳞状细胞癌，癌旁组织和正常粘膜组织均经病理学证实为炎症或正常粘膜。

2 方法和材料

2.1 检测方法：应用免疫组化(S-P)法检测74例喉癌组织、45例癌旁组织和40例正常喉粘膜组织中RECK、MMP-14和VEGF的表达情况。

2.2 标本采集和贮存：74例喉癌组织、45例癌旁组织和40例正常喉粘膜组织皆为手术新鲜标本。标本离体后，一部分放入4%多聚甲醛中行石蜡切片免疫组化研究，一部分做好标记置于液氮中。贮存于零下80°超低温冰箱贮存备查。

2.3 主要试剂：一抗，RECK兔抗人多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，MMP-14兔抗人多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，VEGF兔抗人单克隆抗体为北京中彬金桥公司。二抗，羊抗兔FITC、IgG抗体(Jackson Immtmo Research公司)

2.4 操作流程：所有标本均经过4%中性甲醛固定，常规脱水、包埋、连续切片，如果是冰冻贮存的石蜡切片应常规浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡10min，梯度酒精冲洗，PBS漂洗后侵入柠檬酸中，微波炉抗原修复10min，再次PBS漂洗，滴加一抗液，湿盒内4°C过夜，DAB液显色，PBS漂洗终止反应[2]。苏木素复染，常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下观察。试验设PBS代替一抗为空白对照，作为质量控制标准。

2.5 结果判定：RECK、MMP-14和VEGF判断标准相同，阳性表达染色为细胞膜和细胞质，胞浆为主，周围间质部分着色，以细胞着色均匀完整为阳性细胞。阳性表达收弱到强呈浅黄、棕黄、棕褐色颗粒状。每例随机观察10个高倍视野，镜下(×400)计100个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞占视野总细胞数的百分比，取平均值。阳性细胞数<5%为0分(-)，5%～25%为1分(+)，26%～50%为2分(++)，51%～75%为3分(+++)，染色结果以>25%为阳性表达或者记分2分和3分者视为阳性表达。

2.6 统计学方法：使用SPSS 16.0统计学软件进行分析，计数资料行χ2检验，标准检验α=0.05。

结 果

1 RECK在喉癌中的表达情况，见表1。 根据在细胞中的染色着色，我们按着色的浅深(-～+++)分为四个等级。RECK癌组织中阳性表达率20.26%<癌旁组织中阳性表达率84.45%<正常组织中阳性表达率92.5%。可以看出RECK在癌组织、癌旁组织和正常组织中阳性表达率呈逐渐上升趋势。癌组织中阳性表达例数与癌旁组织阳性表达例数相比有统计学意义(P<0.05)；癌组织中阳性表达例数与正常组织中阳性表达例数相比有统计学意义(P<0.05)；而癌旁组织中阳性例数与正常组织中阳性例数相比无统计学意义(P>0.05)。

表1 RECK在癌组织、癌旁组织、正常粘膜 组织中的阳性表达(%)

2 MMP-14在喉癌组织中的阳性表达，见表2。根据在细胞中的染色着色在细胞浆，我们按着色的浅深(-～+++)分为四个等级。MMP-14在癌组织中的阳性率为78.37%>癌旁组织为31.11%，>正常组织 17.5%。可以看出MMP-14在癌组织、癌旁组织和正常组中阳性表达率呈逐渐下降趋势。癌组织阳性表达例数与癌旁组织阳性例数相比有统计学意义(P<0.05)；癌组织和正常组织阳性例数相比有统计学意义(P<0.05)；而癌旁组织和正常组织阳性例数相比无统计学意义(P>0.05)。

表2 MMP-14在癌组织、癌旁组织、正常粘膜 组织中的阳性表达(%)

3 VEGF在喉癌中的表达情况，见表3。根据在细胞中的染色着色在细胞浆，我们按着色的浅深(-～+++)分为四个等级。以++和+++定为阳性表达，可以看出VEGF在癌组织、癌旁组织和正常组中阳性表达率呈逐渐下降趋势。VEGF在癌组织中阳性表达率为70.26%>癌旁组织阳性表达率24.45%>正常组织10.0%。在癌组织中的阳性例数和癌旁组织阳性例数相比有统计学意义(P<0.05)；癌组织和正常组织阳性例数相比有统计学意义(P<0.05)；癌旁组织和正常组织相比无统计学意义(P>0.05)。

表3 在癌组织、癌旁组织、正常粘膜 组织中的VEGF阳性表达(%)

讨 论

喉癌是一组来源于喉粘膜上皮组织的恶性肿瘤，发病率在5.7%～7.6%，在耳鼻喉科领域中仅次于鼻咽癌和鼻窦癌，位居第三位[3]。好发年龄在50～70岁，以吸烟男性居多。城市高于农村，北方地区高于南方地区，环境污染与发病有关。其中声门型占60%之多，声门上型居中，声门下型很少见。多为鳞状细胞癌，其发生和发展可能与组织中多种因素的原癌基因表达有关[4]。

RECK是1998年日本学者发现的一种新型肿瘤抑制基因，具有独特抵制MMP-14蛋白酶活性和表达作用，可抑制肿瘤的血管形成和侵袭性。许多研究表明，RECK基因作为一个独立因素在肺癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌等肿瘤组织中的表达程度，与患者的预后有密切相关，肿瘤组织中RECK的呈高表达时，则具有较小的侵袭性，提示预后良好[5]。

MMP-14是基质金属蛋白酶家族成员之一，迄今发现的该种酶类有26种，MMP1-26、MMPs通过降解癌细胞的基底膜，提高其恶性程度和转移能力，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移等方面扮演着重要角色[6]。

VEGF是目前所知作用最强的促血管生长因子，又称血管通透因子。由于其特异性高，对新生血管内皮细胞的增殖分裂、迁移、血管构建，起着中心调控作用，是血管内皮细胞特异的有丝分裂源，在肿瘤组织中高表达已被研究者广泛关注。

本文研究发现，RECK在喉癌中的阳性表达率为15/74(20.27%),明显低于癌旁组织和正常组织，提示RECK对喉癌的发生、发展不起关健作用。其在癌组织中表达与癌旁组织表达两者有统计学意义；而癌旁组织和正常组织间无统计学意义。

而MMP-14在喉癌组织中呈阳性高表达，在癌旁组织和正常组织中的阳性表达率呈递减状态。也有不少研究证实，MMP-14在胃癌、乳腺癌等癌症组织中同样呈阳性高表达，与本研究结果相一致。提示MMP-14的表达，可能与喉癌的发生、侵袭和转移有关

本研究还发现，VEGF在喉癌中的阳性表达率为52/74(70.27%),并在有淋巴结转移的情况下呈阳性高表达，提示VEGF有促进肿瘤细胞的转移。VEGF以其强大的促分裂能力，助长了肿瘤细胞的分裂增殖，加速了肿瘤新生血管的形成，增加肿瘤内细胞血管通透性，为转移灶的形成提供了必要的途径和血供[7]。

本研究表明，RECK蛋白在喉鳞癌组织中低表达，其在喉癌的发生发展中应该不起关键作用,但其表达程度有可能与喉癌的侵袭、转移及预后有关，尚待进一步研究。喉鳞癌组织中MMP-14蛋白，VEGF蛋白表达呈正相关，MMP-14与VEGF在刺激喉鳞癌生成、转移中有协同作用[8,9]。有助于分析并寻找喉鳞癌新的基因靶向治疗位点。VEGF蛋白表达水平随肿瘤分化程度的高低而呈现不同的表达，与临床分期的早晚和淋巴结的转移的出现呈正相关。提示其可作为喉癌程度增高的标志。

[1] 鲁赛帅，倪昊生，刘 浩，等.VEGF在喉癌中的表达及临床意义[J].南通大学学报，2013，3：179-181.

[2] 左文娜，胡俊兰，冯立春，等. RECK、MMP-14在喉癌组织中的表达及临床意义[J].山东医药，2012，52(31)：73-74.

[3] 张金玲，费 雁，陈 伟，等.MMP-2、MMP-14、TIMP-2在胃癌组织中的表达及意义[J].华中科技大学学报：医学版，2013，42(2)：227-230.

[4] 徐志华，王继群，张 涛，等.VEGF在喉癌中的表达的Meta分析[J].山东大学耳鼻喉眼学报，2008，22(1)：32-33，45.

[5] 李 楠，李小敏.STAT3与VEGF在喉癌中的研究进展[J].医学综述，2012，18(9)：1319-1321.

[6] 高 珊，卢国友，王竹君，等.PT TG和VEGF-C在喉癌组织中的表达及其与微淋巴管生成的关系[J].重庆医学，2014，43(4)：434-436.

[7] 刘春丽，张圣林，马桂琴，等.MMP-1、Ets-1在喉癌组织中的表达及其临床意义[J].临床耳鼻喉头颈外科杂志，2011，25(24)：322-325.

[8] 许大巍.喉鳞癌患者血浆MMP-9及VEGF-C检测的临床意义[J].中国保健营养，2014，24(4)：109-110.

[9] 武彦昭，施惠晶，景尚华，等.喉癌组织中VEGF-C及其受体VEGFR-3和D2-40表达及意义[J].山东医药，2013，53(41)：4-7.

(收稿：2014-10-23)

* 河北省科技攻关计划项目(062761152)

喉肿瘤/免疫学 @逆转诱蛋白基因 基质金属蛋白酶14/分析 血管内皮生长因子/分析

R392.3

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10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.007