杜仲雄花乙酸乙酯提取物的抑菌活性研究

李 欣,乔家驹,冯汉青,张 敏,关随霞,刘少阳,张素玲

(1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳 471023;2.西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070;3.漯河医学高等专科学校食品工程系,河南漯河 462000)

杜仲雄花乙酸乙酯提取物的抑菌活性研究

李 欣1,乔家驹1,冯汉青2,张 敏1,关随霞1,刘少阳3,张素玲1

(1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳 471023;2.西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070;3.漯河医学高等专科学校食品工程系,河南漯河 462000)

本实验以杜仲雄花为材料,通过打孔法和倍比稀释法,探讨杜仲雄花乙酸乙酯提取物及经过硅胶柱分离得到的六种不同极性提取物对真菌和细菌的抑菌活性,并确定最小抑菌浓度(MIC)。结果显示:杜仲雄花乙酸乙酯提取物对供试金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和黑曲霉均有较好的抑制效果,最小抑菌浓度(MIC)分别为0.0156、0.0156、0.0313、0.0313、0.1250g/mL,对根霉和青霉没有抑制作用。而分离得到的六种提取物按极性不同分别为10%甲醇洗脱所得样品、20%甲醇洗脱所得样品、30%甲醇洗脱所得样品、纯甲醇洗脱所得样品、纯甲醇含氨洗脱所得样品和水洗脱所得样品,其中10%甲醇洗脱所得样品、20%甲醇洗脱所得样品与乙酸乙酯提取物活性相似或有增强,30%甲醇洗脱所得样品、纯甲醇洗脱所得样品对部分细菌有抑制作用,而只有水洗脱所得样品对根霉有抑菌作用。说明杜仲雄花乙酸乙酯提取物和进一步的硅胶柱分离得到的不同极性提取物具有良好的抑菌活性,且硅胶柱的分离能得到更佳的抑菌活性提取物,为杜仲雄花的进一步开发提供依据。

杜仲雄花,乙酸乙酯提取物,抑菌圈,活性

杜仲是中国特有的杜仲科杜仲属植物,杜仲皮作为中草药已有两千年历史。在过去的20年,杜仲作为药用植物和保健品风靡中国和日本[1]。杜仲的主要活性成分为脂素类、环烯醚萜类、黄酮类化合物[2],其主要的药理学活性有降血压[3]、抗肿瘤[4]、抗氧化[5]、抗病毒[6]、抗菌[7]、消炎[8]作用。但是对杜仲的活性研究主要集中在皮和叶子部分,对雄花研究的还很少。本实验室前期结果显示,与杜仲叶相比,杜仲雄花具有更高的镇静催眠活性,且乙酸乙酯提取物是主要的活性组分。但杜仲的抑菌活性是否也集中在乙酸乙酯组分,还未见报道[10-13]。细菌对环境、人类和动物都有危害,据世界卫生组织调查,全球50%的死亡率是由传染病引发的[14]。在植物中,细菌导致叶斑病、火疫病和萎蔫。同时霉菌是危害饲料的主要生物性污染源[15-17]。本实验以杜仲雄花为实验材料,研究其乙酸乙酯提取物及其分离物的抑菌活性,本研究将为新型天然抑菌剂的开发以及杜仲的深入利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)雄花(采自洛阳市汝阳县王坪乡杜仲种植基地),将杜仲雄花除杂,在低温(45℃)条件下干燥10h,含水量在6%～8%,用粉碎机粉碎,过40目筛,置于0～4℃冰箱中保存,备用。

细菌菌种:大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacilllussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、炭疽杆菌(Bacillusanthraci);霉菌菌种:根霉(Rhizopus)、青霉(Pseudomonassp)、黑曲霉(Aspergillusniger),以上供试菌种均有河南科技大学食品与生物工程学院实验中心提供。

乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇(以上均为分析纯) 上海试一化学试剂有限公司;柱层析硅胶(试剂级)青岛勝海精细硅胶化工有限公司;硅胶板 青岛硅海精细硅胶化工有限公司。

细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基;霉菌采用马铃薯培养基。

RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHB-Ⅲ循环水式真空泵 郑州杜甫仪器厂;BS210S型万分之一电子分析天平 北京赛多利斯天平有限公司;DHG-9240A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;SW-CJ-IF单人双面无菌操作台 苏州净化设备有限公司;恒温培养箱 江苏省金坛市亚荣医疗器械厂;立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲雄花提取物的制备 在李欣等前期工作的基础上改进方案[18],将在不同月份不同方向采摘的杜仲雄花烘干并混合均匀。精确称取25g干燥的杜仲雄花,置于500mL圆底烧瓶,采用63℃、3h、60%乙醇、料液比1∶10回流提取,用石油醚处理除去叶绿素及脂质后,采用51℃、53h、料液比1∶10乙酸乙酯回流提取,过滤提取液,干燥至恒重得杜仲雄花乙酸乙酯提取物。

乙酸乙酯提取物样品上硅胶柱,采用氯仿-甲醇系统和梯度洗脱,极性变化如下(按混合洗脱剂中甲醇的含量由小到大标示):甲醇10%、甲醇20%、甲醇30%、纯甲醇、纯甲醇含氨、水,分别为样品1、2、3、4、5、6。用无菌蒸馏水稀释配制成0.5g/mL(C1)、0.25g/mL(C2)、0.125g/mL(C3)3组浓度系列的7组药液,备用。

1.2.2 菌种活化及菌悬液的制备 实验所用菌株使用前先采用划线法接种于平板上,细菌37℃培养24h,真菌28℃培养48h后,挑选典型菌落接种于液体培养基中,在适宜条件下培养待液体培养基变浑浊后,用无菌生理盐水配制成含菌量为1×108～2×108cfu/mL的菌悬液,备用。

1.2.3 抑菌活性测定 采用平板打孔法检测药物对实验用菌的作用效果。在含菌平板上打孔2个,于每孔中各自加入不同种及不同浓度的供试药物0.05mL,待其扩散完全放入培养箱中在适宜温度下培养一定时间(细菌37℃,12h;霉菌28℃,48h)后,用游标卡尺测量抑菌圈的大小,取其平均值作为测定结果。

1.2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用试管稀释法(二倍稀释法),然后在每管内加入20μL菌原液(各管最终含菌量为106～107cfu/mL)。在适宜温度下培养(细菌37℃,12h;霉菌28℃,48h),以浑浊度为指标检查试管中有无供试菌的生长。以肉眼观察,不显示浑浊、供试菌未生长的那一管药液稀释度作为MIC。

1.3 统计学分析

用SPSS 11.5进行统计学分析。独立样本间的差异显著性分析用Nonparametric Tests,包括Mann-Whitney Test、Moses Test、Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test 和Wald-Wolfowitz Test。T检验判定检验结果:p>0.05,不显著;p≤0.05,显著;p≤0.01,极显著。

2 结果与分析

2.1 杜仲雄花乙酸乙酯提取物的抑菌效果

乙酸乙酯提取物各样品不同浓度对各供试菌株抑制效果见表1。

表1 各样品抑菌圈直径Table 1 Antimicrobial test results of different samples

注:表中数据为抑菌圈直径,单位为mm,“-”表示没有抑菌作用。C1:0.5g/mL,C2:0.25g/mL,C3:0.125g/mL。结果表明各样品对各供试菌株的抑制作用显示出计量相关性。

Tukey B test的结果显示,乙酸乙酯提取物浓度为0.125g/mL时,对金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌作用,其抑菌圈直径>15mm;与黑曲霉相比,差异极显著(p<0.01),提取物对黑曲霉也有一定的抑制作用,其抑菌圈直径为7mm;其对根霉和青霉没有抑制作用。

浓度为0.125g/mL,样品1和样品2同样品3相比,对金黄色葡萄球菌的抑菌作用差异显著(p<0.01);样品1、样品2和样品3同样品4相比,对炭疽杆菌的抑菌作用差异显著(p<0.01)。

乙酸乙酯提取物的6种初分物(样品1～6)的抑菌活性实验表明,主要具有抑菌活性的物质集中在样品1和样品2中,并且对金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌和枯草芽孢杆菌具有较好的抑制作用,其对金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌(样品1浓度为0.5、0.25mg/mL;样品2浓度0.5mg/mL)抑菌圈直径>20mm。与此前对菊芋叶片提取物的研究相似,其活性较强的抑菌化合物主要集中在乙酸乙酯提取物中[19]。绿原酸是杜仲中主要的抑菌活性成分[20],本文得到的杜仲乙酸乙酯提取物及其初分物的有效成分是否是绿原酸,还有待进一步的工作。

实验中金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌和枯草芽孢杆菌均属于革兰氏阳性菌,因此猜测样品1和样品2对革兰氏阳性菌抑制作用较佳,这可能与革兰氏阳性菌细胞壁结构简单,药液容易渗透有关,其抑菌机制可能为药物对细胞壁、细胞膜完整性的破坏,但此推论需要进一步实验的证实。

样品3在浓度为0.125g/mL时,对炭疽杆菌的抑菌作用,与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌相比,差异极显著(p<0.01)。

乙酸乙酯提取物、样品1、样品2和样品3对金黄色葡萄球、炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(细菌)的抑菌作用同对根霉、黑曲霉和青霉(霉菌)作用相比差异显著,原因可能分离出的物质针对细菌抑菌,与细菌和真菌的结构特点相关。

样品5对7种供试菌株均无抑制作用,只有样品6对根霉具有一定的抑制作用,说明采用柱层析的方法可以起到分离的效果,使同类活性物质集中,而此实验将对根霉具有抑制作用的有效成分集中在水洗脱的极性相对较大的组分中。同时乙酸乙酯提取物本身没有显示出对根霉的抑菌活性,而其硅胶柱层析分段分离组分样品6表现出对根霉的抑菌活性,说明柱层析的分离方法是分离纯化天然产物生物活性成分的有效手段。水是极性较强的溶剂,与其他溶剂相比,水提取物的抑菌作用相对弱,初步说明一些抑菌成分的极性为中等极性。

2.2 杜仲雄花乙酸乙酯提取物对供试菌的最小抑菌浓度的测定

表2 各样品的最小抑菌浓度Table 2 MIC of different samples(g/mL)

注:表中“-”号表示其MIC>0.5g/mL。最小抑菌浓度测定结果见表2。由表2可知,乙酸乙酯提取物对供试菌的MIC由小到大依次为:金黄色葡萄球，炭疽杆菌<枯草芽孢杆菌，大肠杆菌<黑曲霉。进一步说明乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌的抑菌效果更强;样品1对供试菌的MIC由小到大依次为:金黄色葡萄球,炭疽杆菌<枯草芽孢杆菌<大肠杆菌,黑曲霉。样品2对供试菌的MIC由小到大依次为:炭疽杆菌<金黄色葡萄球<枯草芽孢杆菌<黑曲霉<大肠杆菌。经过进一步分离,样品2的结果显示出对炭疽杆菌更强的抑菌效果。样品3对供试菌的MIC由小到大依次为:炭疽杆菌<金黄色葡萄球,大肠杆菌。样品4仅对炭疽杆菌有抑制作用,MIC为0.0625g/mL。样品6对供试菌的MIC由小到大依次为:金黄色葡萄球<炭疽杆菌，根霉,黑曲霉。不同极性的提取物对不同菌株的最小抑菌浓度顺序不同,显示通过柱层析进一步的分离乙酸乙酯提取物,能够筛选出针对不同病原菌的有效提取物,从而开发出有针对性的抑菌药物。

3 结论与讨论

抑菌性方面10%甲醇洗脱所得样品、20%甲醇洗脱所得样品与乙酸乙酯提取物活性相似或有增强,30%甲醇洗脱所得样品、纯甲醇洗脱所得样品对部分细菌有抑制作用,而只有水洗脱所得样品对根霉有抑菌作用。而在最小抑菌浓度(MIC)方面,杜仲雄花乙酸乙酯提取物对供试金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和黑曲霉均有较好的抑制效果,最小抑菌浓度(MIC)分别为0.0156、0.0156、0.0313、0.0313、0.1250g/mL,对根霉和青霉没有抑制作用。

通过对杜仲雄花乙酸乙酯抑菌实验结果判断,其结果可作为药效学的初步判断依据。本实验对杜仲乙酸乙酯提取物的分离及其抑菌活性分析,将有利于开发专一性抗菌类食品添加剂及抗菌药物。天然药物活性成分的提取及活性鉴定对中药现代化、新药的开发研究意义重大,本实验基于此前提进行了初步研究,以供参考。

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Study on antibacterial activities of the ethyl acetate extract in maleEucommiaflowers

LI Xin1,QIAO Jia-ju1,FENG Han-qing2,ZHANG Min1,GUAN Sui-xia1,LIU Shao-yang3,ZHANG Su-ling1

(1.College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China;2.College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China;3.Food Engineering Department,Luohe Medical Collage,Luohe 462000,China)

In this study,extract of maleEucommiaflowers was obtained by ethyl acetate. Six different polar extracts were further isolated from ethyl acetate extract ofEucommiaby silica gel column chromatography. This study was conducted to investigate the antibacterial activities of these seven extract by using punch method or dilution method. Minimal inhibitory concentration(MIC)of extracts was also determined. Results showed that ethyl acetate extract had good antibacterial activities againstStaphylococcusaureus,Bacillusanthracis,Bacillussubtilis,EscherichiacoliandAspergillusniger. The MIC was 0.0156,0.0156,0.0313,0.0313,0.1250g/mL,respectively. No antibacterial effect was observed onRhizopusorPseudomonassp. The six compounds were named sample obtained by 10% methanol,sample obtained by 20% methanol ,sample obtained by 30% methanol,sample obtained by pure methanol,sample obtained by pure methanol with a few ammonia ,and sample obtained by water according to their polarities isolated by silica gel column chromatography. The activities of sample obtained by 10% methanol and sample obtained by 20% methanol were higher than that of ethyl acetate extract. While,the sample obtained by 30% methanol and sample obtained by pure methanol did not show antibacterial activities on most of strains. Strikingly,the sample obtained by water exhibited antibacterial activities onPseudomonassponly. Thus,the ethyl acetate extract and six compounds isolated by silica gel column chromatography had good antimicrobial activities. Silica gel column chromatography provided good separation of active extract. This research was profitable for the study and use of the maleEucommiaflowers.

maleEucommiaflowers;ethyl acetate extract;inhibitive cycle diameter;activities

2013-12-24

李欣(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：天然产物开发。

国家自然科学基金(31000017、31260059和30900105)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)11-0062-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.004