研究创新性化学开放实验教学设计——链霉菌化感活性物质的提取与分离

李春远，卢其明，陈 敏，罗志刚

（1.华南农业大学 材料与能源学院，广东 广州 510642；2.华南农业大学 公共基础课实验教学中心，广东 广州 510642）

公共基础课实验教学中心的基础化学实验室每年承担资源环境、生命科学、园艺、食品科学、兽医、动物科学、林学、工程、水利与土木工程、理学、农学等11个学院共30多个本科专业开设的6门化学类实验课程，每年上课学生超过4 000人，学生人数多，教学层次多样。所以，从2011年开始，化学实验室结合授课学生专业不同特点，提出了“分层次，跨专业”开放实验教改思路，即根据开放对象专业不同及其与化学学科的相关度进行分类，将参与开放实验的学生分为非化学类、农科类、理工科类、化学类等类型，开放教学内容则分为趣味性、基础性、综合设计性和研究创新性4个教学层次。教学中针对不同专业的学生，选择不同的实验内容进行分层教育。经过数年的教学实践，该模式取得了良好的教学效果。

研究创新性实验教学强调学生的探究和创新，目标是培养学生的创新能力、创新意识、合作精神与科学态度，是完成高校创新人才培养目标的有效途径。在教学过程中创立一种类似科学研究的氛围，学生在教师引导下，用类似科学研究的方式，主动地去进行探索、研究、发现和体验，学会对信息进行收集、对现象进行分析和判断，通过总结获取知识，通过研究应用知识，从而达到增强思考能力和创造能力、培养创新精神和实践能力的目的［1－2］。“研究创新性教学”已经成为发达国家一流大学推崇的教学改革模式［3］。

链霉菌属是绝大多数已知抗生素和一些重要化感活性物质的产生菌［4－8］。在微生物化感活性物质研究中，菌株一般要经过液体深层发酵来产生目标产物，然后对发酵液中活性成分进行提取、纯化再分离出活性物质。大孔吸附树脂具有的低消耗、高效率、高选择性、后续处理简单并且树脂可再生等优势，其在农药、生化药物的分离纯化以及中成药的制备等方面［6，9］的应用越来越广泛。把这些新的实验方法及实验技术运用到实验教学中来，让学生探索实验规律、优化反应条件、降低化学实验室污染的同时，培养学生的实验技能、科研创新能力及环境保护意识，从而达到提高教育和教学质量的目的。

1 优选实验教学材料

微生物中产生抗生素种类和数量最多的类群是放线菌群，用于植物病害生物防治中的主要是链霉菌属及其相关类群［10］，其中许多已经被开发成除草剂、杀菌剂和杀虫剂等［11－12］。作为农业院校，基础化学实验是农业院校最重要的公共基础课之一，所以开设一些与农业专业相关的实验项目有助于学生以后的专业学习。而从学生实验教学的时效性考虑，链霉菌属成为首选，同时，作为学生实验，也不宜采用未研究过的新奇菌株为教学对象。所以从本实验室已筛选获得的具有抑菌及除草活性的放线菌中，选择了一株对多种病原菌具有强烈抑制作用并对稗草也具有抑制作用的链霉菌6803菌株作为研究创新性实验设计教学的材料［13］。

2 设计实验技术流程

“研究创新性教学”的基本特点之一是主张教学方法和手段的多样性，为实现多元化的教学目标，应采用多种教学方法并充分运用现代教育技术［14］。近年来，一些新的绿色化的实验方法更多被引进到化学开放实验教学中来，运用这些新的实验方法及新技术，让学生探索实验规律，降低化学实验室污染，同时也可以激发学生学习化学的兴趣。以活性微生物发酵液为原料，用活性跟踪的方法测定4种不同极性的大孔吸附树脂（NAK－II，AB－8，X－5，HP－20）填料对该菌株发酵液除草活性物质的吸附能力，从中筛选最佳的吸附树脂，并筛选其最佳洗脱剂，提取后的粗提物用制备薄层色谱进行分离、纯化得到目标产物。实验设计技术流程如图1所示。

图1 实验设计技术流程图

3 优选提取、分离及纯化方法

3.1 大孔吸附树脂提取活性物质

研究创新性教学的目的是要增强教学过程中学生的主体地位，体现以“学生发展”为本的教育思想内涵［15－16］。学生通过查阅大量的相关资料获知，在微生物发酵液农用活性物质提取研究中，可以采用溶媒萃取，但溶媒萃取需要大量互不相容的溶剂，萃取过程中还可能会产生乳化现象，定量分析回收率低，萃取时间长，消耗溶剂量大。而大孔吸附树脂具有吸附容量大、吸附速度快、选择性好、再生处理简单、用少量树脂就可以处理大量发酵液等优点，而且在提取的同时也有一定的纯化作用，该方法克服了液液萃取过程因溶剂挥发而污染环境，并且吸附树脂还可以再生后继续使用［17］。

从开放学生实验绿色化的角度考虑，决定采用4种不同极性的大孔吸附树脂（NKA－II、AB－8、X－5、HP－20）对发酵液的目标产物进行提取。发酵液是教师提前准备好分发给各组学生的。实验结果显示，树脂HP－20对发酵液的吸附效果最好，树脂HP－20对发酵液的静态吸附量约可达到树脂体积的8倍，用树脂2～3倍柱体积的80%乙醇—水溶液则可以把吸附的活性物质全部从树脂中解吸出来。该方法既克服了液液萃取过程中溶剂挥发对环境的污染，又节省大量的有机溶剂，并且树脂再生后可以继续使用，既节能又环保。

3.2 采用超声波法洗脱目标产物

利用超声波的空化作用加速活性成分的溶出。我们把已经被发酵液吸附饱和的树脂从层析柱中倒出来，不用以前常规的方法，而改为把吸附饱和的树脂置于三角瓶中，然后先用蒸馏水浸泡，再超声6min，用布氏漏斗抽滤，目的是洗去杂质，滤液保留备用；将饱和吸附的树脂重新转移至三角瓶中，用前面已经筛选过的最佳洗脱剂即80%乙醇—水溶液进行洗脱。与普通动态洗脱相比，本方法只用1/3的溶剂即可洗脱出相同的提取量，同时还节省了大量的时间和能源。本步骤完成后继续用蒸馏水对树脂进行洗涤，把乙醇洗干净，树脂即可再次循环使用。对收集的滤液用旋转蒸发仪进行减压蒸馏，在较低的温度下快速地对样品进行浓缩，收集到的试剂还可以回收再利用。

3.3 制备薄层分离目标产物

制备薄层层析原理与柱层析相似，都是利用硅胶吸附性能使得不同物质在各种极性溶剂条件下解吸能力差异而进行分离纯化［18］。制备薄层层析使用购置的薄层板，在开放实验中提取活性物质的量较少的情况下，制备薄层层析的分离效果要优于柱层析。引导学生慢慢地将样品刷到制备薄层板上，然后在层析缸中慢慢展开，对前面的粗提物进行分离，把点好样的制备薄层板置于展开缸中，比较适合学生实验少量样品的分离纯化，展开后用紫外等显色剂检验，刮取活性物质色谱带，再上小柱，用少量极性较大的溶剂在色谱柱中把活性物质洗脱下来。制备薄层法比柱层析法更加简便，消耗的溶液量少、时间短且绿色化，在1h内，只用150mL试剂即可获得10mg的7，4’—二羟基黄酮（7，4’—dihydroxyflavone）目标产物。

4 用核磁共振谱表征活性物质结构

核磁共振（NMR）仪是天然产物结构鉴定及化学反应机理研究等最常用的工具之一［19－20］，学生首先对薄层制备纯化后得到的产物进行薄层检视，选取了斑点单一、纯度高的样品。样品用真空干燥后，由于比较难溶，所以用DMSO－d6溶剂溶解后装入核磁管中，用Bruke AV600超导磁核磁共振仪得到NMR的H谱和C谱图见图2和图3，并与文献［8，21］对照，鉴定该化合物为7，4’—二羟基黄酮（7，4’—dihydroxyflavone）。

学生通过总结获取知识，通过研究应用知识，从而达到增强思考能力和创造能力、培养创新精神和实践能力的目的。实验结束后，大家集中共同分析实验过程出现的问题并分析实验结果。在实验过程中，有些学生因为装填料时没装密实，加载发酵液的时候，吸附树脂会浮起来。大家热烈地讨论实验的每一个步骤，交流经验，对不满意的实验内容进行重做，直到得出较为满意的实验结果。实验结束后，每组的小组长汇集组员的实验过程资料和实验结果，分析实验过程中出现的问题、解决方法及实验后组员讨论的实验结果，提出实验存在的问题，把实验结果进行整理，制作成PPT，大家相互交流，共同提高。大部分的实验组都能得出较理想的实验结果。

图2 化合物I的1 H－NMR谱

图3 化合物I的13C－NMR谱

5 结束语

近几年来的探索与实践证明，“研究创新性实验”的实验教学模式能适应当前教学改革的要求，能激励学生的求知愿望，能激发学生的成就感与创新欲望，有利于提高学生的实验技能、科研意思和科研能力。近年来，学生获得多项国家级、省级及校级的奖励。下一步将积极配合学校实践教学改革，将重点放在学生科研能力的培养上，充分激发学生的科学激情，并随时根据实验情况调整实验教学方式，真正做到对学生的科学意识、科研能力及创新能力的培养。

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