DD3 mRNA及DD3 mRNA/D定量检测对前列腺特异性抗原灰区前列腺癌诊断的临床价值

李慧峰，吴振启，刘敏，陈磐，陈瑛，郭剑明



论著·临床

DD3mRNA及DD3mRNA/D定量检测对前列腺特异性抗原灰区前列腺癌诊断的临床价值

李慧峰，吴振启，刘敏，陈磐，陈瑛，郭剑明

目的 研究前列腺组织中DD3mRNA及DD3mRNA/D定量检测在前列腺特异性抗原(PSA)灰区前列腺癌临床诊断中的应用价值。方法 选择sPSA4～10ng/ml的前列腺增生(BPH)患者112例和前列腺癌(PC)患者25例，进行RT-PCR、PSA检测、B型超声检查及前列腺穿刺活检。观察其DD3mRNA、DD3mRNA/D、血清PSA(sPSA)、前列腺穿刺活检标本PSA(uPSA)、总PSA/游离PSA比值(f/tPSA)、s/uPSA、PSA密度(PSAD)等参数的差异,并应用ROC曲线分析各参数的诊断价值。结果 2组患者年龄、前列腺体积比较差异无统计学意义(t=12.87、12.31,P>0.05)；tPSA、PSAD比较差异均有统计学意义(t=7.31、6.89,P<0.05)；PC组DD3mRNA/PSAmRNA比值明显高于BPH组(t=7.86,P=0.009)；PC组DD3mRNA/D比值明显高于BPH组(t=7.28,P=0.05)。ROC曲线分析结果表明，以0.27为截断值，DD3mRNA/PSAmRNA的曲线下面积为0.841(95%CI0.666～0.997)；以2.01为截断值，DD3mRNA/D的曲线下面积为0.907(95%CI0.790～0.869)。结论DD3mRNA含量、DD3mRNA/D定量检测可以显著提高检出PSA灰区前列腺癌的敏感度，对PSA灰区前列腺癌的早期筛查诊断意义重大，DD3mRNA/D具有更好的诊断效能。

前列腺特异性抗原;灰区前列腺癌；DD3mRNA/D；DD3mRNA

在西方国家前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性最常见的肿瘤,我国发病率近年来也呈迅速上升趋势[1～3]。前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA) 产生于前列腺上皮细胞,在前列腺腺体的腺泡和腺管上皮细胞内合成,直接分泌于前列腺导管系统[4]。血清PSA(serum PSA,sPSA) 是前列腺癌筛查的常用指标,但是良性前列腺增生症(BPH)、前列腺炎、急性尿潴留(AUR )以及有关前列腺的各种检查(DRE、TRUS)等均可引起PSA 水平升高[5，6]。血清总PSA(total PSA,tPSA)>4 ng /ml 时,前列腺穿刺活检阳性率只有1/3,但在临床应用中，当sPSA在4～10 ng/ml的范围,此时难以根据sPSA水平来区分前列腺癌和BPH,故该区域称为PSA灰区[7]。

国内外学者应用tPSA与游离PSA(free PSA,fPSA)比值( f/ tPSA )、sPSA 与前列腺穿刺活检标本PSA (urine PSA,uPSA)比值(s/uPSA)、前列腺特异性抗原密度(PSA density,PSAD)等参数筛查PSA灰区的前列腺癌，但特异性仍不十分理想[8]。

所以寻找更特异的PC标志物已成为研究的热点。DD3(differential display code 3)是一种前列腺高特异性的非编码RNA。DD3 在前列腺癌标本及前列腺癌转移灶中均有高表达。Northern Blot分析显示DD3高度特异性地表达于前列腺癌细胞,在其他正常组织、肿瘤组织和大量的细胞系中均不表达,被认为是前列腺癌最特异的一种基因。

检测前列腺活检标本中DD3 mRNA和/或DD3 mRNA/D(密度)是否能对PSA灰区前列腺癌有更特异性诊断价值和更高的灵敏度呢？现选择sPSA在4～10 ng/ml 的BPH 或前列腺癌患者137例,观察其前列腺穿刺活检标本中DD3 mRNA、DD3 mRNA/D、sPSA、uPSA、f/tPSA、s/uPSA、PSAD等参数的差异,并应用ROC曲线分析各参数的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年7月—2014年6月复旦大学附属中山医院泌尿外科和复旦大学附属中山医院青浦分院泌尿外科门诊及住院患者137例,纳入标准：sPSA水平在4～10 ng/ml，3个月内未行糖皮质激素治疗，近2周未行尿道器械检查及经直肠操作等筛选。根据穿刺或术后病理活组织检查(活检) 结果分为BPH组和PC组。BPH组112例，年龄63～76(69.6±6.8)岁，病程0～17(8.6±8.5)年,其中合并高血压病33例，糖尿病15例，膀胱结石3例，无明显诱因。PC组25例，年龄67～78(72.4±5.7)岁，病程0～16(8.3±7.2)年,合并高血压病9例，糖尿病3例，膀胱结石1例，脑梗死病史2例。本研究经医院伦理委员会批准，患者及其家属知情同意并签署同意书。

1.2 观测指标 观察2组患者DD3 mRNA、sPSA、uPSA、f/tPSA、s/uPSA、PSAD等参数的差异,并应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析各参数的诊断价值。ROC曲线是用不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线[8]。本研究中ROC计算公式参照文献[9]，分析DD3mRNA、sPSA、uPSA、f/tPSA、s/uPSA、PSAD等参数与临床标准诊断结果之间的异同。该方法可根据实际情况，允许有中间状态，可以把试验结果划分为多个有序分类，如正常、大致正常、可疑、大致异常和异常5个等级再进行统计分析。该方法可以提供DD3mRNA、sPSA、uPSA、f/tPSA、s/uPSA、PSAD等参数任意界限值时的对前列腺癌的识别能力。调节基线(base line)至适宜处,各荧光曲线与基线的交叉点即为Ct(cycle threshold)值,根据标准曲线上的浓度与Ct值的对应关系,可求出各待测标本的初始浓度。

1.3 检测方法

1.3.1 标本收集： 137例患者均于清晨采集空腹肘静脉血2 ml,15 min内分离血清并置于-20℃保存;并行前列腺活检，活检组织-70℃保存。

1.3.2 DD3 mRNA含量测定： (1)RNA抽提：按照经典总RNA抽提试剂盒说明书抽提总RNA后真空干燥。用焦碳酸二乙酯(DEPC)15 μl水溶解。取RNA液2 μl加入水98 μl混匀后在DU800型紫外分光光度仪(北京东迅天地医疗仪器有限公司)上测定A260/A280比值(RNA质量检测)及RNA含量，RNA样品完整性用1%甲醛变性凝胶电泳鉴定。(2)RT-PCR检测:①互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成：取RNA模板样品11 μl,加入O-ligo(dT)0.5 μg /1 μl，具体操作按逆转录试剂盒说明书进行,总反应体积20 μl，最后取2 μl产物用于PCR扩增。②DD3 mRNA 的扩增: 在外显子1和3之间设计一对DD3引物和一条MGB探针。20 μl反应体系中含有上游引物300 nmol/L,下游引物900 nmol/L,MGB探针200 nmol/L,cDNA 2μl，Universal Master Mix (Applied Biosystems)10 μl。③PCR扩增条件: 首先95℃10 min热启动Taq酶,再进行两步法循环扩增:92℃10 s、60℃30 s共50个循环。

1.3.3 PSA检测： 采用瑞典康乃格诊断公司的 CanAg PSA EIA 340210与CanAg Free PSA EIA 350210试剂盒,按说明书应用化学发光法测定血清标本的tPSA (即sPSA)、fPSA及尿标本的uPSA,计算f/tPSA、s/uPSA[10]。

1.3.4 前列腺体积测定[11]： 使用彩色多普勒超声诊断仪经直肠超声(transrectal ultrasound,TRUS)测定前列腺左右径(D1)、上下径(D2)及前后径(D3),计算前列腺体积(V= D1×D2×D3×0.52)、PSAD(PSAD=tPSA/V)及DD3 mRNA密度。

2 结 果

2.1 临床检测指标比较 2组患者的年龄、前列腺体积比较差异无统计学意义(P>0.05)，而tPSA、PSAD比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组临床检测指标比较 (±s)

2.2DD3mRNA含量及密度比较 与BPH组比较，PC组DD3mRNA、DD3mRNA/D比值均明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 2组DD3 mRNA含量及密度的比较 (±s)

2.3DD3mRNA诊断PC性能评价 经ROC曲线分析：(1)将截断值定为0.27，DD3mRNA/PSAmRNA比值的曲线下面积为0.841(95%CI0.666～0.997)。PC组中有22例高于此截断值，DD3mRNA/PSAmRNA比值的灵敏度为86.5%。BPH组中有25例高于此截断值，其特异度为76.8%。阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)分别为75.5%、87.8%，准确度为81.5%。(2)将截断值定为2.01，前列腺穿刺活检标本DD3mRNA/D比值诊断PC的曲线下面积为0.907(95%CI0.790～0.869)。PC组中有23例高于此截断值，DD3mRNA/D比值的灵敏度为93.3%，BPH组中有37例高于此截断值，其特异度为66.7%。阳性预测值、阴性预测值分别为69.2%、92.5%，准确度为78.5%。结果显示，DD3mRNA/D的检验效能更大。见表3、图1。

表3 DD3 mRNA/PSA mRNA、DD3 mRNA/D检测诊断PC的效能比较 (%)

图1 DD3 mRNA/PSA mRNA和DD3 mRNA/D的ROC曲线

3 讨 论

PSA筛查导致前列腺癌诊断时分期有了巨大变化，进展期患者发病率下降[7]。尽管PSA在前列腺癌早期诊断上的作用被肯定，但这种标志物也易出现假阳性，PSA异常人群中约75%活检未发现癌，在PSA<10ng/m1时特异性差，阳性预测值低，尤其是PSA灰区(4～10ng/ml)在临床分析中不能被忽视[8]。尽管有关PSA的研究取得很多进展，包括f/tPSA、PSAD等参数的应用减少了前列腺增生和前列腺炎引起的假阳性，但在前列腺癌诊断特异性上取得的进展有限[9]。经典分子标志物PSA的局限性需要寻找新的分子标志物，使之不仅能准确地发现前列腺恶性病变，而且能够区分低级别的腺性前列腺癌[10～12]。其他生物标本如前列腺按摩后收集的尿液，通过检测分子标志物如DD3已证明在前列腺癌临床诊断和预后分析上有一定价值[13，14]。

DD3基因是1999年Bussemakers等发现的一种前列腺癌特异基因，它是一种非编码RNA[15]。通过Northernblot法分析发现，该基因在前列腺癌细胞有特异性表达，而在正常前列腺细胞、前列腺增生的细胞中不表达或者仅少量表达，在其他肿瘤组织中不表达。与PSA基因相比，DD3基因是一个前列腺癌特异性很强的基因[15，16]。研究发现，与良性组织相比，前列腺癌组织中DD3的含量增加了34倍，即使组织中前列腺癌细胞的含量较少(≤10%)，DD3也能够清晰准确地表达。运用实时定量的RT-PCR技术，能准确量化地检测DD3，具有诊断前列腺癌和判断其预后的价值[17]。

本研究选择137例血清tPSA在4～10ng/ml的BPH或PC患者,进行前列腺穿刺活检，用荧光实时定量RT-PCR方法检测DD3mRNA含量并计算其密度。由于不同的标本中含有前列腺细胞数量不一样，每微克RNA所含前列腺细胞的比例也不同，需要用管家基因对其校正，而PSA在正常前列腺细胞中的表达较恒定，在PC细胞中也仅有轻微下降。故本研究选择PSAmRNA作为前列腺细胞中的“管家基因”来校正前列腺穿刺活检标本中的前列腺细胞数，以消除不同标本之间前列腺细胞数的差异对实验结果的影响，使相对定量结果更可靠[6，18]。

本研究发现，PC患者前列腺穿刺活检标本中DD3mRNA相对定量值(0.36±0.21)与BPH患者(0.12±0.18)相比，差异显著(P=0.009)，DD3mRNA/D比值也显著高于BPH患者(P=0.005)。该结果和胡存利等[18，19]的研究相一致。本文研究结果说明，在综合考虑灵敏度和特异度的情况下，DD3mRNA/D比值在鉴别和诊断PSA灰区前列腺良性增生患者和前列腺癌方面的效能更强。因此，DD3mRNA/D比值可以在PSA灰区前列腺癌的筛检和早期鉴别诊断中发挥作用。

1FujitaA,GomesLR,SatoJR,etal.Multivariategeneexpressionanalysisrevealsfunctionalconnectivitychangesbetweennormal/tumoralprostates[J].BMCSystBiol,2008,2(1):106.

2LaxmanB,MorrisDS,YuJ,etal.Afirst-generationmultiplexbiomarkeranalysisofurinefortheearlydetectionofprostatecancer[J].CancerRes,2008,68(3):645-649.

3PloussardG,DurandX,XylinasE,etal.Prostatecancerantigen3scoreaccuratelypredictstumourvolumeandmighthelpinselectingprostatecancerpatientsforactivesurveillance[J].EurUrol,2011,59(3):422-429.

4ShintaniM,MatsuiK,InoueJ,etal.Single-cellanalysesrevealedtransferrangesofIncP-1,IncP-7,andIncP-9plasmidsinasoilbacterialcommunity[J].ApplEnvironMicrobiol,2014,80(1):138-145.

5RobertG,JanninkS,SmitF,etal.RationalbasisforthecombinationofPCA3andTMPRSS2:ERGgenefusionforprostatecancerdiagnosis[J].Prostate,2013,73(2):113-120.

6HansenJ,AuprichM,AhyaiSA,etal.Initialprostatebiopsy:developmentandinternalvalidationofabiopsy-specificnomogrambasedontheprostatecancerantigen3assay[J].EurUrol,2013,63(2):201-209.

7EvansJ.Recentdealhighlightshopesforcancer-killingviruses[J].NatMed,2011,17(3):268-269.

8MuthanaM,GiannoudisA,ScottSD,etal.Useofmacrophagestotargettherapeuticadenovirustohumanprostatetumors[J].CancerRes,2011,71(5):1805-1815.

9SchmidtC.Amgenspikesinterestinlivevirusvaccinesforhard-to-treatcancers[J].NatBiotechnol,2011,29(4):295-296.

10 赵强,王琳,窦红芹,等.多西紫杉醇联合雌二醇氮芥治疗晚期雄激素非依赖性前列腺癌临床疗效评价[J].疑难病杂志,2013,12(8):642-644.

11 杜雄，惠起源，尹香利，等.PSA、CgA及PCA3在前列腺癌中的表达及临床意义[J].解放军医药杂志,2014,26(2):47-49.

12 梁晓玲,张莉,李伟,等.Ezrin蛋白在前列腺癌组织中的表达及意义[J].解放军医药杂志,2012,24(11):5-7.

13PerdonàS,CavadasV,DiLorenzoG,etal.Prostatecancerdetectioninthe"greyarea"ofprostate-specificantigenbelow10ng/ml:head-to-headcomparisonoftheupdatedPCPTcalculatorandChun'snomogram,tworiskestimatorsincorporatingprostatecancerantigen3[J].EurUrol,2011,59(1):81-87.

14LeytenGH,HesselsD,SmitFP,etal.Identificationofacandidategenepanelfortheearlydiagnosisofprostatecancer[J].ClinCancerRes,2015,35:120-124.

15ZhangKJ,WangYG,CaoX,etal.Potentantitumoreffectofinterleukin-24geneinthesurvivinpromoterandretinoblastomadouble-regulatedoncolyticadenovirus[J].HumGeneTher,2009,20(8):818-830.

16BollitoE,DeLucaS,CicilanoM,etal.Prostatecancergene3urineassaycutoffindiagnosisofprostatecancer:avalidationstudyonanItalianpatientpopulationundergoingfirstandrepeatbiopsy[J].AnalQuantCytolHistol,2012,34(2):96-104.

17SchiewerMJ,AugelloMA,KnudsenKE.TheARdependentcellcycle:Mechanismsandcancerrelevance[J].MolCellEndocrinol,2012,352(1/2,SI):34-45.

18 胡存利,王超,牛文斌,等.血清EPCA-2联合尿液PCA-3检测在前列腺癌诊断中的临床意义[J].黑龙江医药科学,2013,36(5):37-38.

19LinHP,LinCY,HuoC,etal.Caffeicacidphenethylesterinducedcellcyclearrestandgrowthinhibitioninandrogen-independentprostatecancercellsviaregulationofSkp2,p53,p21Cip1andp27Kip1[J].Oncotarget,2015,6(9):6684-6707.

Quantitative detection of DD3 mRNA and DD3 mRNA/D in patients with early clinical diagnosis of prostate cancer with PSA in diagnostic gray zone

LIHuifeng,WUZhenqi,LIUMin,CHENPan,CHENYing,GUOJianming.DepartmentofUrology,ZhongshanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,QingpuBranch,Shanghai201700,China

WUZhenqi,E-mail:wzq0719@hotmail.com

Objective To study the expression of DD3 mRNA and DD3 mRNA/D in the diagnosis of prostate cancer in PSA gray zone.Methods One hundred and twelve patients with sPSA 4-10 ng / ml of benign prostatic hyperplasia (BPH) and 25 cases of prostate cancer (PC) were enrolled, RT-PCR and PSA were test, B type ultrasonography and biopsy of prostate were performed. Observed the difference of the DD3 mRNA, DD3 mRNA/D, serum PSA(sPSA), prostate puncture biopsy specimens of PSA (uPSA), total / free PSA ratio (f/ tPSA), s/uPSA, PSA density (PSAD) etc. parameters, and used ROC curve to analyze the diagnostic value of each parameter.Results Two groups’ patients’ age, prostate volume showed no statistical significance differences (t=12.87,t=12.31,P>0.05);TPSA,PSAD’sdifferenceshowedstatisticssignificance(t=7.31,t=6.89,P<0.05);PCgroup’sDD3mRNA/PSAmRNAratioweresignificantlyhigherthanthatofBPHgroup(t=7.86,P=0.009);PCgroup’sDD3mRNA/DratiosignificantlyhigherthanBPHgroup(t=7.28,P=0.05).ROCcurveanalysisshowedthatwhencut-offvaluewas0.27,theDD3mRNA/PSAmRNA’scurveareawas0.841 (95%CI0.666-0.997);whencutoffvaluewas2.01,thecurveareaofDD3mRNA/Dwas0.907 (95%CI0.790-0.869).Conclusion DD3 mRNA content and quantitative DD3 mRNA/D detection can significantly improve the detection sensitivity of the PSA gray zone prostate cancer, has great significance for PSA gray zone prostate cancer early screening and DD3 mRNA/D has better diagnostic efficiency.

Prostate specific antigen; Gray zone prostate cancer; DD3 mRNA/D; DD3 mRNA

上海市青浦区科学技术发展基金项目(No.2011-38)

201700 上海，复旦大学附属中山医院青浦分院泌尿外科

吴振启，E-mail:wzq0719@hotmail.com

2015-02-26)

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.07.017