牛CAPN1基因遗传变异及其对胴体性状的效应分析

武秀香等

摘要[目的]探讨钙蛋白酶1（CAPN1）基因在中国黄牛不同群体中的变异以及CAPN1基因作为影响牛肉质性状候选基因的可能性，寻找与牛肉质性状相关的分子标记。[方法]采用PCRSSCP对雷琼牛、云南高峰牛、BMY牛与中国西门塔尔牛共367个个体CAPN1基因Exon11Exon16与Intron21遗传变异检测，运用GLM模型分析检测到的遗传变异与中国西门塔尔牛部分肉质性状的关联性。[结果] 发现CAPN1基因DNA序列中的2个突变位点A4558G和C4684T，分别检测到AA/AG/GG和CC/CT/TT 3种基因型，优势基因分别为A和G。效应分析结果表明， A4558G多态对骨重、胴体产肉率及肉骨比性状效应显著（P<0.05），C4684T多态对宰前活重、净肉重、胴体重、头重、骨重、前蹄重、网膜油重及肠系膜油重性状效应显著（P<0.05）。[结论]CAPN1基因可以作为肉牛胴体性状的主效基因或与主效基因相连锁的一个标记。

关键词钙蛋白酶1基因；群体遗传分析；胴体性状；SNP

中图分类号S813.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）29-054-03

钙蛋白酶 （Calcium activated neutral protease，CAPN），是一种广泛存在于动物细胞中的蛋白水解酶，在机体发生与神经系统、肌肉生长、细胞信号转导与凋亡等过程中发挥重要作用。CAPN首次发现于大鼠脑组织中，目前已对其结构及表达进行了大量研究。CAPN参与了肌肉中肌原纤维的水解过程，因此也直接参与了肌肉生长和畜禽屠宰后嫩化的过程。钙蛋白酶能降解肌原纤维蛋白，因此推测其可能通过对肌原纤维蛋白进行特异的局部降解而对其结构和功能进行调控。Calpain是活体肌肉组织中导致肌纤维降解的关键因素。Doumit和Koohmaraie认为钙蛋白酶可能通过对肌原纤维蛋白进行特异的局部降解。Richard认为肌原纤维被钙蛋白酶降解释放出的粗肌丝和细肌丝可与母体或其他肌原纤维重新装配，也可被胞质蛋白酶或溶酶体降解。目前，有关CAPN1基因与牛肉肉质（如IMF）的遗传相关性已有大量研究，但关于这一基因对肉牛胴体性状的效应则未见报道。基于此，笔者对CAPN1基因对中国西门塔尔牛胴体性状的效应进行了系统分析。笔者以分析CAPN1基因在中国西门塔尔牛、云南高峰牛、雷琼牛和BMY牛等4个中国黄牛群体中的遗传变异水平为手段，探讨该基因对中国西门塔尔牛胴体性状的效应，以期找出肉牛肉用性能的独特遗传标记，为培育我国黄牛肉用新品系提新的供理论依据与支持。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1血样采集与屠宰测定。共采集了黄牛血样367份，颈静脉采血8 ml，肝素钠抗凝，-80 ℃条件下保存备用。采集群体均为成年牛，其样本采集地区与规模分别为：内蒙古自治区的中国西门塔尔牛132头，云南省草地动物科学研究院育成中的BMY牛81头，云南省思茅地区云南高峰牛80头，海南省琼中县雷琼牛保种场雷琼牛74头。另外，中国西门塔尔牛屠宰后经排酸嫩化处理（4 ℃、24 h），根据文献[12]的方法测定相关屠宰指标。

1.1.2试验试剂。试验试剂均购自TaKaRa 公司（大连）（除注明出处外）。

1.1.3引物设计。涉及的引物均参照文献[8]。

1.2DNA提取采用常规酚氯仿提取法，依据文献[13]中方法提取采集血液样本中的基因组DNA，并依据测定浓度进行浓度校正。

1.3PCR-SSCP与测序

PCR反应体系：总体积20 μl，10×buffer 2.0 μl、dNTP（10 mmol/L）0.5 μl、Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.3 μl、上下游引物各（10 pmol/μl）1.0 μl、模板DNA（100 ng/μl）1.0 μl、ddH2O 14.2 μl。PCR反应程序：95 ℃预变性，5 min；94 ℃变性 40 s，58 ℃复性 40 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。4 ℃，下保存备用。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶检测后，取2 μl于灭菌离心管中，加入6 μl变性上样缓冲液（95%去离子甲酰胺）、10 mmol/L EDTA（pH 8.0）、0.25%二甲苯青FF、0.25%溴酚蓝，98 ℃ 变性10 min，冰浴至上样时取出。10% Acr-bis（29∶1）聚丙烯酰胺凝胶电泳，120 V 14 h，银染后判型。

SSCP分型后，每个基因型随机挑选2个样本，用DNA回收试剂盒（TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0）纯化后回收，正反向直接测序（上海生物工程技术有限公司）。

1.4数据统计与分析

数据处理使用SPSS17.0软件，一般线性模型（General linear model，GLM）分析各基因型与测定胴体性状指标之间的相关性，采用以下模型：Yijk=μ+Markeri+Agej+eijk。其中，Yijk为个体表型记录，μ为群体均值，Markeri为基因型效应与基因型组合效应，Agej为年龄效应，eijk为随机误差。

2结果与分析

2.1CAPN1基因的SNP分型

分别对中国西门塔尔牛、雷琼牛、云南高峰牛和BMY牛CAPN1基因进行PCR-SSCP分析，结果发现了2个多态位点（图1）。根据试验结果，选取带型特征明显的样本，进行测序分析，并与GenBank序列（登录号为AF248054）进行比对。经比对发现，中国西门塔尔牛、雷琼牛、云南高峰牛和BMY牛CAPN1基因分别在4 558 bp和4 684 bp处出现了C/T碱基突变與A/G碱基突变（图2）。

2.2群体间基因分布由表1可知，CAPN1 A4558G位点优势基因为A，优势基因型为AA型。CAPN1 C4684T位点优势基因为C，但群体间基因分布情况不同，本地黄牛群体为CC型，培育群体为CT型。

2.3CAPN1基因与胴体性状的关联分析由表2可知，CAPN1的A4558G位点遗传变异与骨重、胴体产肉率及肉骨比显著相关，其中骨重性状GG基因型显著低于杂合型个体AG （P<0.05）。从胴体产肉率和肉骨比来看，GG型个体显著高于AG型个体（P<0.05），与AA型个体差异不显著（P>0.05）。CAPN1的C4684T位点遗传变异与宰前活重、胴体重、骨重、净肉重、头重、前蹄重、胃重、肠系膜油重及网膜油重显著相关，其中CT基因型个体宰前活重、胴体重、头重及网膜油重的性状显著高于TT型个体（P<0.05）；净肉重、骨重、胃重CT型高于CC型（P<0.05）；前蹄重CT型显著高于CC和TT型（P<0.05）；肠系膜油重TT型显著高于CC型（P<0.05）。

3讨论

作为影响牛肉肉质的主效基因之一，钙蛋白酶在牛肉的成熟嫩化过程中是重要的内源蛋白酶之一。长期以来，CAPN1基因其遗传变异对肉嫩度效应的相关研究颇多。笔者前期研究发现CAPN1基因的优势基因型组合对大理石花纹评分和剪切力2个性状效应低于其他基因型组合3.20%和15.22%（P<0.05），具有较高的培育潜力。然而，CAPN1与肌肉生长性状关联分析的研究较少。笔者在前期试验研究的基础上，进一步分析了CAPN1基因2个SNP位点对中国西门塔尔牛主18个胴体性状的遗传效应，结果发现A4558G位点的遗传变异对胴体重与宰前活重等重要胴体性状具有显著效应，同时也发现肠系膜油与网膜油重等脂肪相关性状也有特定效应，说明机体脂肪沉积过程中CAPN1基因发挥了一定作用，也从侧面证实了CAPN1基因与肉质性状的关系，初步确定CAPN1基因可以作为调控我国肉牛部分屠宰性状的主效应基因或与主基因紧密连锁。这些证据从另外一个角度证实了CAPN1基因对肉牛生产性状的改良具有重要理论意义。

4结论

通过对牛CAPN1基因2个变异位点在中国北方南方黄牛群体中群体遗传分析以及与中国西门塔尔牛肉质性状的效应分析，进一步证实CAPN1基因作为牛肉用性能的遗传标记具有重要的理论意义。

安徽农业科学2015年

参考文献

[1]

MACQUEEN D J，DELBRIDGE M L，MANTHRI S，et al.A newly classified vertebrate calpain protease，directly ancestral to CAPN1 and 2，episodically evolved a restricted physiological function in placental mammals[J].Molecular biology and evolution，2010，27（8）：1886-1902.

[2] NATTRASS G S，CAFE L M，MCINTYRE B L，et al.A posttranscriptional mechanism regulates calpastatin expression in bovine skeletal muscle[J].Journal of animal science，2014，92（2）：443-455.

[3] RASOULI Z，ZEREHDARAN S，AZARI M A，et al.Genetic polymorphism of the CAPN1 gene is associated with meat quality traits in Japanese quail[J].British poultry science，2013，54（2）：171-175.

[4] DOUMIT M E，KOOHMARAIC M.Immunoblot analysis of calpaststin degradation：Evidence for cleavage by calpain in postmortem muscle[J].Journal of animal science，1999，77（6）：1467-1473.

[5] KOOHMARAIE M，SHACKELFORD S D，WHEELER T L，et al.A muscle hypertrophy condition in lamb（callipyge）：Characterization of effects on muscle growth and meat quality traits[J].Journal of animal science，1995，73（12）：3596-3607.

[6] RICHARD I，BROUX O，ALLAMAND V，et al.Mutations in the protelytic enzyme calpain 3 cause limbgirdle muscular dystrophy typeA [J].Cell，1995，81（1）：27-40.

[7] HUANG J，FORSKERG N E.Role of calpainin skeletal muscle protein degradation[J].Proceedings of the national academy of sciences，1998，95（21）：12100-12105.

[8] 武秀香，施雪奎，吳海涛，等.CAPN1基因遗传变异及其对牛肉质性状的效应分析[J].中国农业科学，2011，44（6）：1466-1473.

[9] LIU X，USMAN T，WANG Y，et al.Polymorphisms in epigenetic and meat quality related genes in fourteen cattle breeds and association with beef quality and carcass traits[J].Asianaustralia journal of animal science，2015，28（4）：467-475.

[10] TAIT R G JR，SHACKELFORD S D，WHEELER T L，et al.CAPN1，CAST，and DGAT1 genetic effects on preweaning performance，carcass quality traits，and residual variance of tenderness in a beef cattle population selected for haplotype and allele equalization[J].Journal of animal science，2014，92（12）：5382-93.

[11] LI X，EKERLJUNG M，LUNDSTRM K，et al.Association of polymorphisms at DGAT1，leptin，SCD1，CAPN1 and CAST genes with color，marbling and water holding capacity in meat from beef cattle populations in Sweden[J].Meat science，2013，94（2）：153-8.

[12] 周光宏，孙宝中，刘丽，等.牛肉质量分级：NY/T 676-2003 [S].北京：中国标准出版社，2003.

[13] SAMBROOK J，RUSSELL D W.Molecular cloning[M].3rd edn.New York：Cold Spring Harbor，2001.