HPLC法同时测定普乐安片中槲皮素和山奈素含量

单丽芳 ，孙锦帆，曾 鑫，袁 彩，张 林 ，高 天

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075;2.楚雄老拨云堂药业股份有限公司，云南 楚雄 675000； 3.巧家县中医院，云南 昭通 654600;4.成都中医药大学 附属医院，四川 成都 610072)



HPLC法同时测定普乐安片中槲皮素和山奈素含量

单丽芳1，孙锦帆2*，曾 鑫3，袁 彩1，张 林1，高 天4

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075;2.楚雄老拨云堂药业股份有限公司，云南 楚雄 675000； 3.巧家县中医院，云南 昭通 654600;4.成都中医药大学 附属医院，四川 成都 610072)

目的：建立普乐安片中槲皮素和山奈素的含量测定方法。方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)为流动相，检测波长为360nm。理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于2 500。结果：槲皮素在0.029～0.290μg质量浓度范围内，与主峰面积积分值呈良好线性关系，r=0.999 8，平均回收率为98.40%，RSD值为0.332%；山奈素在0.056 38～0.563 80μg质量浓度范围内，与主峰面积积分值呈良好线性关系，r=0.999 6，平均回收率为98.31%，RSD值为0.386%。结论：HPLC法测定普乐安片中槲皮素和山奈素，灵敏、准确、重现性好，可用于其质量控制。

普乐安片；槲皮素；山奈素；HPLC；含量测定

普乐安片为薄膜衣片，除去包衣后，外表呈黄色或棕黄色，味甜、微涩。其主要成分为油菜花花粉，可补肾固本，用于肾气不固所致的腰膝酸软，尿后余沥或失禁及慢性前列腺炎、前列腺增生的治疗[1]，可作为慢性前列腺炎的首选药物。药典以测定槲皮素和山奈素的含量控制该制剂的主要成分之一油菜花粉的含量。曾经有文献报道用HPLC测定普乐安片中槲皮素的含量[2]，但很少有两者同时测定的报道。本实验采用HPLC法同时测定普乐安片中槲皮素和山奈素，为有效控制该药品质量提供科学依据。

1 仪器、试药与试剂

1.1 仪器

岛津2010型液相色谱仪(自动进样器、紫外检测器、恒温柱温箱)；安捷伦色谱柱XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)；万分之一电子天平(Precisa92SM-202A)；AS10200A数控超声仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

1.2 试药与试剂

槲皮素对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：100081-200406，纯度97.3%)；山奈素对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：110861-200808，纯度95.9%)；甲醇(美国Fisher色谱纯)、磷酸(色谱纯)，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。样品：楚雄老拨云堂药业有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)为流动相，检测波长为360nm，理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于2 500，体积流量为1.0mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 槲皮素、山奈素混合对照品溶液制备 取槲皮素对照品、山奈素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL分别含12μg、25μg对照样品的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取干燥至恒重的供试品，研细，取约0.6g，精密称定，加25%盐酸-甲醇(1∶6)混合溶液40mL，于80℃下加热回流30min，迅速冷却至室温，移至50mL容量瓶中，用甲醇5mL洗涤回流瓶，洗液并入同一量瓶中并加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照液制备 按照处方比例称取除槲皮素、山奈素外的其余成分，按照普乐安片的制备工艺和供试品溶液制备方法制成阴性对照液。

2.3 专属性试验

按照“2.1”项下色谱条件分别取槲皮素、山奈素混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液进样分析，记录色谱图。主峰与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且各组分互不干扰，阴性对照在相应位置上未见色谱峰，本方法专属性良好。

图1 阴性对照色谱

图2 槲皮素、山奈素对照品色谱

图3 普乐安片样品色谱

2.4 线性关系考察

精密吸取槲皮素对照品溶液(0.029 0mg·mL-1)适量，用甲醇稀释成0.002 9mg·mL-1、0.005 8mg·mL-1、0.008 7mg·mL-1、0.011 6mg·mL-1、0.014 5 mg·mL-1、0.017 4mg·mL-1、0.020 3mg·mL-1、0.023 2mg·mL-1、0.026 1mg·mL-1、0.029 0mg·mL-1的槲皮素对照品溶液；同法精密吸取山奈素对照品溶液(0.056 380mg·mL-1)，用甲醇稀释成0.005 6380mg·mL-1、0.011 276mg·mL-1、0.016 914mg·mL-1、0.022 552mg·mL-1、0.028 190mg·mL-1、0.033 828mg·mL-1、0.039 466mg·mL-1、0.045 104mg·mL-1、0.050 742mg·mL-1、0.056 380mg·mL-1的山奈素对照品溶液，按照“2.1”项色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积积分值。以峰面积积分值(Y)为纵坐标，以浓度(X)为横坐标，结果表明槲皮素的回归方程为Y=44 683 097.18X-1 661.8，R=0.999 8，在0.029 00～0.290 00μg范围内呈良好线性关系；山奈素的回归方程为Y=45 625 759.19X-3 157.9，R=0.999 6，在0.056 38～0.563 80μg范围内呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液10μL，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，记录峰面积积分值。计算得槲皮素的RSD值为0.418%，山奈素的RSD值为0.343%。结果表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

按照“2.2.2”项下方法制备供试溶液，取同一样品溶液(批号：20130103)分别于放置0、2、4、8、14h后进行测定，计算得槲皮素峰面积积分RSD值为0.364 4%，山奈素峰面积积分RSD值为0.161 3%，结果表明本品在14h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批号(批号：20130103)样品6份，精密称定，按照“2.2.2”项下制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，计算每片药中槲皮素和山奈素的含量。结果测得平均每片普乐安片含槲皮素0.313mg、山奈素0.903mg，槲皮素含量RSD值为0.535%、山奈素RSD值为0.329%，表明本方法重复性良好。

2.8 回收率试验

取6份已知含量的样品加入一定量的槲皮素、山奈素对照品，按照“ 2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.1”项下色谱条件测定。结果表明，槲皮素对照品平均回收率为98.40%，RSD值为0.332%；山奈素对照品平均回收率为98.31%，RSD值为0.386%。见表1、表2。

表1 槲皮素对照品回收率

2.9 样品测定

取6批样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，记录峰面积。根据含量测定结果，普乐安片中槲皮素和山奈素总量均超过1.000mg。表明该6批普乐安片中槲皮素和山奈素含量符合药典规定，均为合格产品。

表2 山奈素对照品回收率

表3 样品中槲皮素和山奈素含量

3 讨论

3.1 流动相选择

本研究首先采用甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)作为流动相[2]，槲皮素色谱峰能较好分离，但山奈素峰形欠佳，分离效果不好，后改用以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)为流动相。

3.2 提取方式选择

槲皮素、山奈素属于黄酮类成分，主要以苷的形式存在于油菜花粉中[3]。在实验过程中，对温浸、超声、回流三种提取方法进行比较，结果显示温浸、超声提取含量均较低，回流提取较为完全。由于槲皮素、山奈素在高温、过酸的情况下会被破坏，在研究中采用25%盐酸溶液-甲醇的混合溶液进行提取[4]。采用25%盐酸溶液-甲醇(1∶4)、25%盐酸溶液-甲醇(1∶6)分别于80℃、100℃回流20、30、50min，结果显示采用25%盐酸溶液-甲醇(1∶6)、80℃加热回流30min提取效果最好。

本研究采用HPLC 法同时测定普乐安片中槲皮素和山奈素含量，结果表明该方法准确性、重现性、专属性均较好，可作为普乐安片中槲皮素和山奈素含量的定量分析方法。

[1] 中华人民共和国卫生部.中华人民共和国卫生部药品标准[M].北京:人民卫生出版社,1964.

[2] 周利章,韩静.HPLC法测定普乐安片中槲皮素的含量[J].中国药品标准,2007,8(1):53-55.

[3] 郭娟丽,张培成,张智武.油菜花粉的化学成分研究[J].中国中药杂志,2009,34(10):1235-1237.

[4] 郑国平. RP-HPLC 法测定普乐安片中槲皮素和山柰素[J].中草药,2011,42(4):719-721.

(责任编辑：尹晨茹)

Content Determination of Quercetin and Kaempferol in Pule’an Tablets using HPLC Determination

Shan Lifang1,Sun Jinfan2*,Zeng Xin3,Yuan Cai1,Zhang Lin1,Gao Tian4

(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China;2.Lao Bo Yun Tang, Chuxiong 675000,China;3.TCM Hospital of Zhaotong,Zhaotong 654600,China; 4.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610072,China)

Objective:To establish an assay method for the determination of quercetin and kaempferol in Pule 'an Tablets by HPLC.Methods:The chromatographic column:XDB-C18;mobile phase:Methanol-0.4%phosphoric acid (50∶50) detection waveleng th:360nm.Results:quercetin showed a good linear relationship in the range of 0.029～0.290μg (r=0.999 8).The averge recovery was 98.40% and RSD=0.332%;kaempferol showed a good linear relationship in the rang e of 0.056 38～0.563 80μg (r=0.999 6).The averge recovery was 98.31% and RSD=0.386%.Conclusion:The method was simple,sensitive and accurate with good reproducibility. The methods may be used for quality control of Pule 'an Tablets.

Pule'an Tablets;Quercetin;Kaempferol;HPLC;Content Determination

2015-05-28

单丽芳(1989-)，女，成都中医药大学硕士研究生，研究方向为中药理论与应用、制剂。E-mail:465352726@qq.com

孙锦帆(1973-)，男，楚雄老拨云堂药业股份有限公司工程师，研究方向为中药新制剂。E-mail:381324501@qq.com

R284.2

A

1673-2197(2015)20-0017-03

10.11954/ytctyy.201520008