固相萃取净化-液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸

陶大利，孙久玉

（1. 农业部乳品质量监督检验测试中心，哈尔滨 150090；2. 完达山乳业股份有限公司哈尔滨 150090）

引言

核苷酸是由含氮的碱基、环状核糖或脱氧核糖、磷酸3种分子连接而成，碱基与糖通过糖苷键连接成核苷，核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷、肌苷，核苷与磷酸以酯键链连成核苷酸（见图1），称为核酸的组成单位[1]。研究表明，核苷酸在生命活动中不仅是遗传信息功能分子[2]，而且还起着许多复杂而重要的生理调节作用，如有效的降低腹泻的风险、保持体内微生物环境的平衡、提高免疫功能、调控脂质代谢[3～5]、调节生理活动等[6]。由于在婴幼儿配方奶粉中添加适量的核苷酸，有助于婴幼儿胃肠的生长发育[7]，因此众多乳品企业将核苷酸作为一种重要的添加剂应用于婴幼儿配方奶粉中。

目前，还没有核苷酸检测的国标方法，在一些文献报道中重要采用的方法有液相色谱法[8～11]、离子色谱法[12]、液相色谱-质谱法[13]、荧光法[14]、毛细管电泳法[15]等。比色法易受干扰，毛细管电泳法结果重现性较差，离子色谱法和液相质谱法检测成本较高，不利于在企业中普及，液相色谱法具有操作简单，分析速度快，重现性好等特点，但核苷酸极性较强，在反相色谱柱上保留较弱，特别是CMP，并且奶粉的基质又较复杂，给液相色谱法在核苷酸检测中的应用造成不小的困难。

图1核苷酸（CMP、UMP、GMP、IMP、AMP）和核苷（I、C、U、G、A）

本研究使用极性相对较强Gemimi C18色谱柱，磷酸缓冲盐做流动相，并用SPE小柱采用通过的方式净化样品，使5种核苷酸与干扰物质得到良好的分离。本方法操作简单，灵敏度高，适合于乳企日常的分析检测工作。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

乙腈：色谱纯，SK公司；核苷酸标准品：CMP、UMP、AMP、GMP、IMP，Dr.Ehrenstorfer；氢氧化钾：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸二氢钾：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；冰乙酸：优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；SPE固相萃取柱：Strata-X，60mg/3mL，广州菲罗门公司。

高效液相色谱仪：e2695（带紫外检测器），Waters公司；超声波清洗器：KQ-7000E型，昆山市超声仪器有限公司；固相萃取装置：12孔，SUPELCO。

1.2 标准溶液配制

分别称取CMP、UMP、GMP、IMP、AMP用水溶解定容至100mL，需校正水分和钠盐。

1.3 仪器条件

色谱柱：菲罗门Gemimi C18 250×4.6mm，5μm；

流动相：A 0.1M 磷酸盐缓冲液（13.6g KH2PO4，加900mL水溶解，用KOH调PH5.20～5.30，定容至1L，过0.45μm滤膜）：B 乙腈；梯度洗脱见表1。

表1梯度洗脱程序

柱温：室温；

波长：260nm；

治疗期内：试验组mMRC、CAT、CCQ治疗后均较治疗前有改善，而对照组除mMRC外，CAT、CCQ较治疗前有改善，且试验组mMRC、CAT改善均优于对照组，但CCQ比较无差异；随访期：试验组mMRC、CAT、CCQ均较治疗前有改善，而对照组除mMRC外，CAT、CCQ也较治疗前有改善。两组相比，试验组mMRC、CAT改善均优于对照组，而CCQ两组比较无差异。说明不论是有效性还是远期效果，试验组均优于对照组。

进样量：10μL；

1.4 样品处理

1.4.1提取：称取5g（精确到0.1mg）样品至50mL容量瓶中，加入适量40℃水溶解样品，再加入2mL10%醋酸溶液，混匀超声5min，冷却至室温定容至度，混合均匀过滤待净化。

1.4.2净化：SPE小柱分别用3mL甲醇，3mL水活化，取4mL提取液上样，同时在SPE柱下用10mL刻度离心管收集流出液，流出后再加入2.5mL20%甲醇溶液洗脱，合并流出液，流出液用水定容至10mL，过0.45μm滤膜上机测试。

2 实验结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1色谱柱及流动相的选择

文献中液相色谱法测定核苷酸一般均采用C18色谱柱，由于核苷酸的极性较强，即使在一些极性较强的反相C18柱上的保留也比较弱，为提高核苷酸在色谱柱上的保留，文献中的方法大多采用离子对试剂做为流动相，如四丁基硫酸氢铵[16]、四丁基溴化铵[11]等。这种离子对试剂流动相一方面平衡时间长，另一方面对PH值要求极高，而且经常变化，CMP含量占核苷酸总量的50%左右，所以CMP的分离是实验重中之重，为获得CMP良好分离，每次可能都要对pH值进行反复的微调，耗费大量的时间。本方法采用极性较强的Gemimi C18柱进行分离，仅用磷酸缓冲盐做流动相即可获得良好的分离。经过实验，发现当pH值发生改变时，对5个目标峰的保留时间影响不大，且出峰顺序不发生改变，但对部分杂峰的保留时间影响较大，当pH为5.6时，UMP与杂峰，分离度R＜0.5，随着PH值的降低，此杂峰向CMP方向移动，当pH低至5.1时，则杂峰与CMP不能分离，分离度R＜0.5，经过测试当PH值在5.20～5.30之间时就可以使5个目标峰与干扰物质都获得良好分离，分离度R＞2。最终确定色谱柱为Gemimi C18，流动相为0.1M磷酸缓冲盐（pH 5.20～5.30）。标准溶液谱图见图2，标准溶液谱图与样品谱图叠加见图3。图中横坐标为保留时间（min），纵坐标为响应值（AU）。

2.1.2样品溶剂的选择

由于样品处理中使用20%甲醇洗脱，使样品中含有一定比例的甲醇，经过实验发现，样品中甲醇含量的高低，则会影响目标峰的峰形，特别是CMP，由图4可以看出，当溶液中甲醇含量＞6%时，CMP为肩峰（见图4上半部分），其他目标峰不受影响，当甲醇含量≤5%时，CMP峰形则变得尖锐（见图4下半部分），故上机的样品应根据含量用水进行适当的稀释使样品中甲醇含量低于5%。

图2标准溶液谱图

图3标准溶液谱图与样品谱图叠加

图4样品中甲醇含量对CMP的影响（标准品色谱图）

表2线性方程及检出限

表3加标回收率结果

表4精密度试验结果（n=6）

奶粉样品中主要的干扰物质为蛋白质和脂肪，实验中要考虑将蛋白质和脂肪除去，同时将核苷酸提取出来，因此实验设计用水溶解奶粉，通过超声进一步溶解样品，直接加入2mL 10%乙酸溶液定容过滤。该方法操作简单。为了更好的除去脂肪干扰物，让样品采用通过的方式过Strata-X固相萃取柱，脂肪类干扰物吸附在固相萃取柱上，而目标物不与SPE柱作用全部直接流出，从而起到样品净化的目的，提高了样品的分离度，可进一步延长色谱柱的使用寿命。

2.2 方法学评价

2.2.1线性及检出限评价

根据样品含量，将核苷酸标准溶液稀释成不同浓度的标准系列溶液，按上述色谱条件进样，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，通过回归计算等到回归方程和相关系数，以3倍信噪比（S/N）计算方法的检出限见表2。

2.2.2准确度和精密度评价

方法准确度评价采用加标回收率进行评价，选取婴儿配方奶粉加入三个不同浓度的核苷酸混合标准溶液，进行回收率试验结果见表3。

精密度评价采用对三种婴幼儿配方奶粉进行6平行试验，计算核苷酸总量，结果见表4。

3 结论

通过对流动相和样品前处理条件的优化，实现了一次性进样使5种核苷酸均得到良好的分离，且操作简便、条件稳定。

通过方法学评价得出方法线性良好，相关性均在0.999以上；准确度试验各组分回收率均在91%以上；精密度试验RSD%均在3.5%以下。

综上所述，采用固相萃取净化，HPLC测试婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量是一个较理想的方法，该方法操作简单、容易掌握，能够满足乳品企业常规检测的需求。

[1] 张婷婷, 曾明飞, 金燕, 等. 反相高效液相色谱-串联质谱法测定母乳及奶粉中核苷和核苷酸的含量. 分析化学, 2014, 4(42): 585-591.

[2] 程翠林, 王振宇, 赵海田, 等. 研磨珠辅助提取茶树菇水溶性核苷酸工艺优化. 农业工程学报, 2011, 10(10): 370-374.

[3] Gutierrez C P, Mora M, Diaz G L,et al.Immune response to nucleotide-supplemented infant formulae: systematic review and meta-analysis. British Journal of Nutrition, 2007, 98(1):64-67.

[4] Yau K I, Huang C B, Chen W,et al.Effect of nucleotides on diarrhea and immune responses in healthy term infants in Taiwan.Gastroenterol Nutr., 2003, 36(1):37-43.

[5] Coppa G V, Zampini L, Galeazzi T,et al.Prebiotics in human milk:a review. Dig Liver Dis., 2006, 38(2): 291-294.

[6] 李进国, 张新辉. 外源核苷酸与运动功能研究. 吉林体育学院学报, 2007, 23(6): 88-89.

[7] Carver J D. ActaPaediatrica, 1999,88(430): 83-88.

[8] 张燕婉, 鲁红军, 王津生. 高效液相色谱法测定食品中核苷酸的含量, 食品科学, 1994, 6: 59-62.

[9] 任一平, 黄百芬, 连国义, 等. 应用HPLC反相色谱快速测定增鲜味精中鸟苷酸和肌苷酸. 食品与发酵工业, 1994, 6: 36-41.

[10] 黄小兰, 李科德, 陈华云. 15种核酸产物的高效液相分离及其酵母抽提物分析中的应用, 分析化学研究简报, 2000, 28(12): 1504-1507.

[11] 张秋梅, 郝岩平, 宋戈. 高效液相色谱法测定乳粉中的核苷酸, 中国乳品工业, 2009, 4: 51-54.

[12] 叶明利, 潘广文, 胡忠阳, 等. 离子色谱法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸, 色谱, 2010, 9(9): 898-901.

[13] Inoue K, Obara R, Hino T,et al.Development and application of an HILIC-MS/MS method for the quantitation of nucleotides in infant formula. J Agric Food Chem, 2010, 58(18): 9918-9924.

[14] 郭秋平, 杨小海, 王柯敏, 等. 基于聚合酶反应和发夹型核酸适体的蛋白质荧光检测方法. 高等学校化学学报, 2008, 29(1): 37-40.

[15] 赵星洁, 刘英华. 毛细管电泳分离啤酒废酵母中4种5'-核苷酸. 中国酿造, 2007, 173(8): 68-71.

[16] 郝岩平, 姜金斗. 反相高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸方法的研究. 中国食品添加剂, 2003, 2: 114-118.