高山被孢霉发酵生产花生四烯酸发酵条件优化

李 霞，王道会，徐建春

（青岛琅琊台集团股份有限公司，山东 青岛 266400）

花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）属于n-6系列多不饱和脂肪酸，是前列腺素、环前列腺素和白三烯类等二十碳衍生物的直接前体[1]。ARA具有多种生理功能，可降低血脂，缓解胰岛素抵抗，促进神经系统发育和视网膜发育，尤其对于胎儿和婴幼儿脑部发育具有重要作用[2]。ARA目前被广泛应用于保健品、药品及婴幼儿食品领域，其传统生产工艺主要是从动物肝脏、猪肾上腺、蛋黄和深海鱼油中直接提取[3]，产量低且受季节影响，无法满足市场需求。而微生物发酵法生产ARA具有生产周期短，不受原料、产地和季节限制等明显的优势，目前已成为ARA的主流生产模式[4]。高山被孢霉（Mortierella alpina）被认为是最佳的ARA 生产菌株。该菌株具有ARA 含量高且脂肪酸组成合理等特点，是目前ARA生产方面的研究热点[1]。

影响高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的因素很多，林炜铁等[5]曾报道不同的接种方式和接种量会对被孢霉（Mortierellasp.）的菌丝形态产生影响，采用孢子接种且孢子浓度为4.0×105个/mL时，菌体形态为分散丝状，可得到最大生物量和出油率。而PARK E Y等[6-7]研究发现，过大的搅拌速率和通气量会产生较大的剪切力，剪切下的被孢霉菌丝消耗碳源进行自身修复，使ARA的合成受到影响；较低直径的小球状菌体更利于ARA的合成。碳源和氮源是影响微生物生长的最关键营养元素。当微生物处于营养充足和条件适宜的环境中，细胞内各种代谢较为活跃且处于平衡状态，在此阶段菌体代谢以促进细胞生长为主，而细胞中脂质含量则维持在较低水平；当环境条件改变时，菌体内代谢平衡被打破，有利于某些代谢产物的积累[8]。当培养基中氮源及磷、锌、镁等微量元素缺乏，但碳源充足时，微生物将停止生长进入脂积累代谢状态[9]。周蓬蓬等[10]研究发现，培养温度在25 ℃时，高山被孢霉菌丝生长快速，而20 ℃培养可获得最大出油率和ARA含量，最佳培养方式为分段控温方法；而秦新政等[11]研究发现，在培养温度为31 ℃时可获得最大菌丝生长速率。培养基pH值是影响微生物生长的另一重要环境因素，目前报道的高山被孢霉的最佳培养基pH值主要集中在6.0～7.0[12-13]，偏酸性环境适宜高山被孢霉的脂质积累[14]。

本研究利用诱变育种筛选一株高山被孢霉高产花生四烯酸菌种，针对该菌种进行了培养条件的优化，并进行10 L自动发酵罐的放大验证实验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株由青岛琅琊台集团股份有限公司科海研究所自行驯化保存。

1.1.2 培养基

活化培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：土豆200 g/L，葡萄糖2%，琼脂1%。

种子液体培养基：葡萄糖35 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，MgSO40.8 g/L，KH2PO41 g/L，（NH4）2HPO41.2 g/L，Na2SO40.4 g/L，pH 6.0～7.0，120 ℃条件下灭菌30 min。

发酵基本培养基：葡萄糖50 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨8 g/L，MgSO41 g/L，KH2PO41 g/L，（NH4）2HPO41.5 g/L，（NH4）2SO40.6 g/L，CaCl2·2H2O 0.5 g/L，pH 6.0～7.0，120 ℃条件下灭菌30 min。

1.1.3 化学试剂

MgSO4、KH2PO4、（NH4）2HPO4、（NH4）2SO4、CaCl2·2H2O、Na2SO4等无机盐试剂均为分析纯：天津巴斯夫化工有限公司。

1.2 仪器与设备

PL602-L型电子天平、FE20型pH计：上海梅特勒托利多公司；DZG-6090型电热真空干燥箱：上海森信实验仪器公司；RE52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HYL-C型组合式摇床：太仓强乐实验设备有限公司；HSY10L型全自动发酵罐：无锡汇森生物设备有限公司；Trace1300型气相色谱仪：美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将保存菌种接种于PDA培养基平板，于26 ℃条件下活化培养5～7 d。

1.3.2 种子培养

从活化培养基刮下孢子接种于种子培养基中，装液量为100 mL/500 mL，26 ℃、摇床转速180 r/min 条件下培养5 d，作为发酵种子液。

1.3.3 摇瓶培养

将种子液中菌体用分散机打散，以一定浓度将菌体片段接种于发酵基本培养基中，装液量100 mL/500 mL，26 ℃、摇床转速180 r/min条件下培养5～7 d。

1.3.4 菌体干质量的测定

将摇瓶培养得到的发酵液抽滤得到菌体，以蒸馏水冲洗3次，抽滤冲洗液；将得到的菌体置于45 ℃恒温干燥箱中烘至质量恒定。菌体干质量计算公式如下：

1.3.5 菌体脂质提取

将干菌体粉碎后加入正己烷，采用索氏抽提法[15]进行脂质提取，所得提取液在40 ℃下减压蒸馏，获得菌体脂质。菌体出油率计算公式如下：

1.3.6 菌体脂质的脂肪酸组成分析及ARA含量分析

样品前处理及菌体脂质脂肪酸组成采用高效气相色谱法测定，具体操作参照国标GB 26401—2011《食品安全国家标准食品添加剂花生四烯酸油脂（发酵法）》中对于发酵生产ARA的定量检测方法。ARA含量指ARA在菌体油脂的脂肪酸组成中所占比例，其计算公式如下：

1.3.7 单因素试验及放大试验设计

综合前人研究成果和预试验结果，本实验选定温度、时间、摇床转速、碳氮比和pH值作为单因素实验变量，以优化高山被孢霉的培养条件。为验证优化后培养条件的生产应用效果，本实验采用10 L全自动发酵罐，对优化后的培养条件进行放大实验。

2 结果与分析

2.1 摇床转速对菌体形态及发酵产物的影响

高山被孢霉属于丝状真菌，在进行液体培养时会呈现不同的菌体形态，主要有球状和丝状。球状菌体是由菌丝紧密地缠绕组成单个独立体，丝状菌体则是菌丝均匀地悬浮在整个液体培养基中，不同的菌体形态会对出油率和ARA含量产生影响。本实验发现，采用菌体片段接种时，接种量对菌体形态无显著影响，均为小球状；而影响菌体形态的主要因素为培养转速。摇床转速单因素试验培养条件为24 ℃条件下培养7 d，pH值为6.0，碳氮比为2.5，摇床转速梯度设计为80 r/min、120 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，结果见表1。

表1 摇床转速对菌体形态及发酵产物的影响Table 1 Effect of the rotate speed on mycelial morphology and fermentation results

由表1可知，当转速较低处于80～120 r/min时，菌丝缠绕较为紧密，菌体形态为直径较大的球状，菌体干质量和出油率较低。随着转速的增长，球状菌体直径逐渐减小；当转速达到200 r/min时，菌体形态变为丝状。实验结果表明，当摇床转速为180 r/min时，菌体为直径1～2 mm小球状，菌体干质量、出油率和ARA含量均达到最高，分别为45.5 g/L，24.8 g/L和50.6%；而菌体为丝状时，菌体干质量和出油率均有所下降；得出培养最佳摇床转速为180 r/min。

2.2 碳氮比对发酵产物的影响

本实验碳氮比分别设计为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0共7个梯度，发酵周期7 d，温度24 ℃，pH值为6.0，摇床转速180 r/min，结果如图1所示。

图1 碳氮比对发酵产物的影响Fig.1 Effect of C/N ratio on fermentation results

由图1可知，在发酵完成后，当碳氮比达到2.5时，可获得最大菌体干质量为49.0 g/L；而之后随着碳氮比的持续升高，菌体干质量开始下降，说明较低的含氮量开始降低菌体的生长速度。碳氮比达到3.0时可获得最大出油率和ARA含量，分别为24.8 g/L和49.8%，此后随着碳氮比的上升，总体出油率开始由于生物量的降低而下降，ARA含量则基本不变。因此，综合出油率和ARA含量，培养基最佳碳氮比应控制在3.0。

2.3 温度对发酵产物的影响

图2 温度对发酵产物的影响Fig.2 Effect of temperature on fermentation results

本实验采用恒温发酵，分别设定发酵温度为18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃，发酵周期7 d，pH值为6.0，摇床转速180 r/min，碳氮比为3.0，对发酵温度进行进一步优化，结果如图2所示。

由图2可知，培养温度在28 ℃时，菌体生长迅速，可获得最大生物量，菌体干质量为45.6 g/L。而温度为26 ℃时可获得最大出油率和ARA含量分别为23.6 g/L和48.8%，因此综合考虑最佳发酵温度为26 ℃。

2.4 pH值对发酵产物的影响

本实验设定pH值分别为6.0、6.2、6.5、6.8、7.0，发酵温度26 ℃，周期7 d，摇床转速180 r/min，碳氮比为3.0，考察pH值对发酵产物的影响，结果如图3所示。

图3 pH值对发酵产物的影响Fig.3 Effect of pH on fermentation results

由图3可知，pH值为6.5时，可获得最大出油率达到22.6 g/L，ARA含量为45.1%；而生物量和ARA含量均在pH值为6.2时达到最高，分别为46.7 g/L和51.1%，出油率为21.7 g/L。以ARA产量为主要考量指标，综合考虑培养基pH值为6.2较好。

2.5 发酵时间对发酵产物的影响

按照优化后的发酵条件对高山被孢霉进行摇瓶培养，培养基碳氮比3.0，pH值为6.2，发酵温度26 ℃，摇床转速180 r/min，发酵时间分别为1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d。发酵结束后测定菌体干质量、出油率及ARA含量，考察发酵时间对发酵产物的影响，结果见图4。

图4 发酵时间对发酵产物的影响Fig.4 Effect of fermentation time on fermentation results

由图4可知，菌体的快速生长期为第2～3天，同时伴随着油脂的迅速积累；菌体干质量在第4天可达42.7 g/L，随后增长缓慢，出油率在第5天达到最高为21.7 g/L，随后基本稳定；ARA含量也在第5 天达到最高为50.6%，随后有所下降。因此，采用优化后发酵条件培养5 d即可获得最大ARA含量。

2.6 10 L发酵罐放大实验

在摇瓶发酵的基础上，采用10 L全自动发酵罐进行3次放大试验，装液量60%，接种量10%，消泡剂为聚氧丙烯甘油，发酵温度26 ℃，罐压0.05～0.08 MPa，通气量4 000 L/h，发酵液pH值为6.2，发酵周期5 d，发酵结束后测定菌体干质量、出油率及ARA含量，实验结果如表2所示。

表2 10 L发酵罐放大实验Table 2 Amplification test for 10 L fermentation cylinder

由表2可知，在优化后培养条件下，5 d发酵后平均菌体干质量为45.4 g/L，出油率为24.1 g/L，ARA含量为49.6%，菌体形状为球状，直径1～2 mm。发酵产物及ARA产量与摇瓶培养相当，证明采用优化工艺扩大培养的可行性。

3 结论

本实验以发酵所得菌体干质量、出油率和ARA含量为主要参考指标，对高山被孢霉摇瓶培养的发酵条件进行了优化。通过对摇床转速、培养基碳氮比、发酵温度、pH值等参数进行单因素变量分析，确定本株高山被孢霉菌种的最佳培养条件为摇床转速180 r/min，培养基碳氮比3.0，发酵温度26 ℃，pH 值为6.2，发酵时间为5 d。在保持发酵参数不变的情况下，在10 L发酵罐进行放大实验，装液量60%，接种量10%，通气量4 000 L/h，发酵周期缩短至5 d，所得菌体干质量、出油率和ARA含量分别为45.4 g/L、24.1 g/L和49.6%。证明了该发酵工艺的可行性，为进一步扩大培养提高生产效率打下基础。

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