希望I号液对大鼠吸入臭氧肺损伤的保护作用研究

张微 刘甜甜 祖承哲 彭金娥 冯丽莉 王湘 张燕 蔡大勇 王玥琦

臭氧在全球和区域大气环境变化中扮演着重要角色，作为城市污染大气中的重要污染物，引发很强的环境效应［1］。而且，臭氧还会跟其他污染物联合作用，臭氧加强PM 2.5 对人体的危害［2］。希望Ⅰ号液由中药枸杞子和大枣组成，二者均有抗氧化增强免疫力的作用［3-4］，但未出现其防治臭氧损伤的报道。本研究采用大鼠吸入臭氧模型，灌胃给予希望I 号液，观察希望Ⅰ号液对臭氧所致肺损伤的保护功能。

1 材料与方法

1.1 试药

希望I 号液由枸杞子11 g、大枣6 g 组成(出自《太平圣惠方》枸杞子散)生药饮片均购自北京同仁堂药店，由北京中医药大学基础医学院中医药基础理论与关键技术中心配制;维生素E(Vitimin E，VE)软胶囊(生产批号:20130104)由青岛双鲸药业有限公司生产。

1.2 动物

健康成年SD 雄性大鼠48 只，体质量220 ～253 g［北京维通利华公司，实验动物使用许可证号:SCXK(京)2012-0001］。

1.3 仪器与试剂

臭氧发生器(山东精工好医生仪器有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(生产批号:20130406)、过氧化脂质(lipid peroxide，LPO)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、测定试剂盒(批号:20140522)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)(生产批号:20130326)均购自南京建成生物工程研究所;肺表面活性蛋白-A(surfactant protein A，SP-A)抗体购自santacurz 公司;羊抗兔链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫组化试剂盒购于武汉博士徳公司。

1.4 动物分组及模型建立

48 只雄性SD 大鼠，随机分为6 组，即对照组、模型组、维生素E 组、希望I 号液低、中、高剂量组各8 只。

除对照组外，其余各组都放入自制臭氧染毒柜中暴露臭氧(1.2 ±0.2 ppm)。所有老鼠自由饮食饮水。灌胃剂量:维生素E 组为0.0135 g/kg，希望I号液低、中、高剂量组为0.045、0.090、0.180 g/kg，臭氧造模同时给药。45 天结束造模，处死各组动物。

1.5 血清中SOD、LPO、CAT、GSH-Px 检测

腹主动脉取血，离心吸取血清，-80℃冻存，测定前取出血清解冻，按照试剂盒说明书方法测定血清中SOD、LPO、CAT 和GSH-Px。

1.6 肺组织病理学观察检测

将麻醉后的大鼠的胸腔打开，取左肺叶，10%福尔马林固定48 小时，PBS 清洗，修块，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，4 μm 切片，脱蜡透明后，HE 染色［5］、Masson 染色，光学显微镜下观察。计量胶原纤维面积和总面积，计算胶原纤维面积比。

1.7 免疫组化检测肺组织SP-A 含量

将石蜡切片脱蜡后进行SABC 法免疫组化染色。石蜡切片脱蜡、水化后，3%H2O2避光孵育1 小时，置于枸橼酸缓冲液中微波抗原修复，BSA 封闭后滴加一抗4℃过夜，洗脱后滴加二抗37℃孵育30分钟，SABC 37℃孵育30 分钟后DAB 显色，苏木素复染核，中性树胶封片，扫描。采用Image Pro Plus软件对图像进行处理。随机选取5 视野计量阳性细胞面积(A)、平均光密度值(D)、积分光密度值(IOD)，计量阳性表达量。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 希望I 号液降低臭氧吸入大鼠血清LPO 含量

血清LPO 经F-text 分析后结果如表1所示(F =4.034，P ＜0.01)，(1)与对照组比较，模型组大鼠血清中的LPO 含量显著升高(P ＜0.01)。(2)与模型组比较，希望I 号液各治疗组大鼠血清LPO 含量显著降低，有差异性(P ＜0.05，P ＜0.01)。(3)将模型组作为给药零剂量组，直线相关回归显示希望I 号液的用药剂量与大鼠血清LPO 含量之间高度负相关(y=-0.0314x +0.5317，R2=0.7597，P ＜0.05);提示希望I 号液降低臭氧吸入大鼠血清过氧化脂质有剂量依赖特征。

表1 希望I 号液对大鼠血清中SOD、LPO、CAT、GSH-Px 含量(±s，n=8)

表1 希望I 号液对大鼠血清中SOD、LPO、CAT、GSH-Px 含量(±s，n=8)

注:与对照组比较，aP ＜0.05 与模型组比较，bP ＜0.05。

组别 LPO(nmol/L) SOD(U/mL) CAT(U/mL) GSH-Px(μmol/L)对照组 12.57 ±1.39b 78.43 ±7.54b 60.82 ±6.34b 91.42 ±3.40 b模型组 17.46 ±1.42a 55.60 ±2.27a 28.73 ±4.28a 76.00 ±1.22a维生素E 组 14.87 ±1.44 62.24 ±2.40a 47.88 ±6.93ab 94.16 ±3.19ab希望I 号液低剂量组 14.27 ±3.54b 56.37 ±3.33a 36.41 ±2.65a 89.09 ±0.91b中剂量组 13.35 ±1.37b 75.04 ±5.79b 50.70 ±5.89b 89.55 ±1.50b高剂量组 12.62 ±2.35b 69.06 ±7.02ab 48.84 ±6.38ab 91.17 ±2.89 b

2.2 希望I 号液回升臭氧吸入大鼠血清SOD 活性

血清SOD 经F-text 分析后结果如表1所示(F=15.177，P ＜0.01)，(1)与对照组比较，模型组大鼠血清SOD 活力含量显著降低(P ＜0.01)。(2)与模型组比较，希望I 号液中、高剂量治疗组大鼠血清SOD 活力回升，差异具有显著性(P ＜0.01)，低剂量治疗组SOD 活力略有增高，但无统计学差异。

2.3 希望I 号液回升臭氧吸入大鼠血清CAT 活性

血清CAT 经F-text 分析后结果如表1所示(F=16.579，P ＜0.01)，(1)与对照组比较，模型组大鼠血清CAT 活力含量显著降低(P ＜0.01)。(2)与模型组比较，希望I 号液中、高剂量给药组大鼠血清CAT 活力回升，差异具有显著性(P ＜0.01)。低剂量治疗组CAT 活力略有增高，但无统计学差异。(3)将模型组作为给药零剂量组，直线相关回归显示希望I 号液的用药剂量与大鼠血清CAT 活力之间高度正相关(y=0.0062x-0.176，R2=0.707，P ＜0.05);提示希望I 号液回升臭氧吸入大鼠血清CAT 具有剂量依赖特征。

2.4 希望I 号液回升臭氧吸入大鼠血清GSH-Px 活性

血清GSH-Px 经F-text 分析后结果如表1所示(F =53.328，P ＜0.01)，(1)与对照组比较，模型组大鼠血清GSH-Px 活力含量显著降低(P ＜0.01)。(2)与模型组比较，希望I 号液各治疗组大鼠血清GSH-Px 活力回升，差异具有显著性(P ＜0.01)。

2.5 希望I 号液缓解臭氧吸入大鼠肺组织损伤

肺组织HE 染色结果如图1所示，对照组大鼠的肺组织中肺泡间隔均匀;模型组出现了明显的肺泡扩张并伴有塌陷现象，肺泡大小不一;维生素E组肺泡结构完整，未出现肺泡扩张现象;低、中剂量给药组肺泡扩张现象有所缓解，肺泡大小不均匀;高剂量给药组与维生素E 组相似，肺泡大小比较均匀。

图1 各组大鼠肺组织HE 染色切片(×200)

2.6 希望I 号液回降大鼠肺组织胶原纤维沉积

如图2所示肺组织胶原纤维经Masson 染色显示为墨绿色。数据经Welch 方差分析后如表2所示(F' =30.504，P ＜0.01)，对照组大鼠的肺组织中气管周围胶原纤维较薄。(1)与对照组比较，模型组大鼠肺组织胶原纤维含量上升，差别有显著性(P ＜0.01)。(2)与模型组比较，各治疗组大鼠肺组织胶原纤维含量回降，差别有显著性(P ＜0.01)。(3)将模型组作为给药零剂量组，直线相关回归显示希望I号液的用药剂量与大鼠肺组织原位SP-A 含量之间高度正相关(y =-1.5757x +0.1855，R2=0.6616，P ＜0.05)，提示希望I 号液保护臭氧诱导肺损伤具有剂量依赖特征。

图2 各组大鼠肺组织Masson 染色切片(×200)

2.7 希望I 号液回升大鼠肺损伤原位表面活性物质

如图4所示SP-A 表达阳性为黄褐色。对照组SP-A 表达量较多，主要分布于肺泡Ⅱ型细胞，少量位于巨噬细胞和支气管上皮细胞中。SP-A 形态剂量经Welch 统计后结果显示(表2)(F' =24.022，P ＜0.01)，希望I 号液显著回升大鼠肺损伤原位表面活性物质。(1)与对照组比较，模型组大鼠肺组织原位SP-A 显著下降，差别有显著性(P ＜0.01)。(2)与模型组比较，各治疗组大鼠肺组织原位SP-A显著回升，差别有显著性(P ＜0.01)。(3)将模型组看做给药零剂量组，直线相关回归显示希望I 号液的用药剂量与大鼠肺组织原位SP-A 含量之间高度正相关(y = 0.0062x- 0.4186，R2= 0.7808，P ＜0.05);提示希望I 号液保护嗅氧诱导肺损伤具有剂量依赖特征。

表2 希望I 号液缓解大鼠肺损伤(±s，n=8)

表2 希望I 号液缓解大鼠肺损伤(±s，n=8)

注:与对照组比较，aP ＜0.01;与模型组比较，bP ＜0.01

组别 胶原纤维面积比 SP-A 表达量对照组 4.10% ±1.08% b 88.11 ±7.77 b模型组 12.52% ±3.57% a 66.20 ±7.89a维生素E 组 4.34% ±1.68% b 88.03 ±9.99b希望I 号液低剂量组 6.33% ±1.37% b 78.28 ±8.43ab中剂量组 4.23% ±0.30% b 88.69 ±7.80b高剂量组 4.03% ±0.56% b 88.37 ±8.44 b

图4 各组大鼠肺组织SP-A 免疫组化染色结果(×400，×800)

3 讨论

随着社会经济发展，环境污染问题越来越受到人们的普遍重视。臭氧作为夏季的首要污染物［6］，其危害作用也受到人民的广泛关注。臭氧可造成肺组织损伤，引发哮喘、支气管肺炎等肺部疾病［7-8］。有少量清热解毒、益气活血类［9-10］中药缓解肺损伤报道，但中药缓解臭氧所致肺损伤的文献甚少。希望Ⅰ号液中枸杞子可滋补肝肾、益精明目，大枣具有补中益气、养血安神功能。本品从中医脾肾论治保护肺功能，符合中医临床培土生金、金水相生治则，达到增强机体抵御外界伤害能力，从而为临床防治肺损伤提供实验依据。

SOD、CAT、GSH-Px 是抗氧化酶系统中重要组成部分。SOD、GSH-Px 水平反映机体氧化-抗氧化平衡，机体受到臭氧染毒后，这种平衡被打破，出现SOD、GSH-Px 活力降低的现象，SOD、GSH-Px 在臭氧导致氧化应激反应中起防御作用［11-12］。SOD、CAT、GSH-Px 活力下降，可能是由于臭氧造成DNA 损伤有关［2］。同时，根据LPO 结果显示，经过臭氧染毒的模型组含量明显增高，与文献报道相一致［13］。臭氧导致肺纤维化和抗氧化物酶活性降低，肺损伤模型成功。

希望Ⅰ号液各给药组LPO 水平均低于模型组，并回升抗氧化物酶活性，希望Ⅰ号液可能通过加速过氧化物的代谢从而减轻过氧化反应对机体的损伤。

肺组织形态学观察表明:模型组巨噬细胞数量增多出现肺纤维化病灶，胶原纤维沉积，说明臭氧导致了大鼠肺部组织损伤。应用希望Ⅰ号液后，肺组织炎性细胞减少，纤维化现象减轻，从而有效地保护大鼠肺组织。

研究显示SP-A 由肺泡Ⅱ型细胞分泌，其主要作用维持肺泡结构，在肺损伤时参与抗氧化反应，具有一定的防御功能与免疫调节作用［14］。臭氧破坏机体的氧化平衡，可见模型组SP-A 免疫组化阳性表达减少。希望Ⅰ号液中、高剂量组和维生素E组的SP-A 表达量，与对照组相比无统计学差异，说明希望Ⅰ号液中、高剂量组和维生素E 组有很好的保护肺泡的能力。

综上所述，希望Ⅰ号液对于吸入臭氧导致的肺损伤具有保护作用，升高抗氧化物酶活性，减轻肺纤维化。而希望Ⅰ号液保护臭氧所致大鼠肺损伤的机制，可能是通过诱导抗氧化物酶激活，保护肺泡Ⅱ型细胞从而发挥保护作用。

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