人炎症及正常牙髓干细胞生物学特性的比较研究

关丽娜，贺 莹，韩 冰，孙雪飞，杨 帆

（1．军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科，陕西西安710032；2．兰州军区乌鲁木齐总医院口腔科，新疆乌鲁木齐830000）

人炎症及正常牙髓干细胞生物学特性的比较研究

关丽娜1，2，贺 莹1，韩 冰1，孙雪飞1，杨 帆1

（1．军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科，陕西西安710032；2．兰州军区乌鲁木齐总医院口腔科，新疆乌鲁木齐830000）

目的：比较人炎症及正常牙髓干细胞的（iDPSCs和DPSCs）的生物学特性。方法：体外培养纯化、扩增iDPSCs和DPSCs分别检测其细胞表面特异标记物的表达、细胞增殖率、克隆形成率；然后分别对两种干细胞进行成骨、成脂诱导，并用RT－PCR检测其成骨／成牙、成脂分化相关基因的表达。结果：炎症和正常来源的DPSCs均阳性表达CD146、CD105、CD90和CD29，不表达CD45及CD31，两种干细胞各表面标志物的表达无显著性差异（P＞0．05），细胞增殖能力和单克隆形成数／率均无显著差异（P＞0．05）。两种干细胞经矿化诱导后，茜素红染色可见iDPSCs的矿化结节小于DPSCs，两者的ALP活性亦无显著性差异（P＞0．05）；成脂诱导后油红－O染色均呈阳性反应。RT－PCR检测结果显示，经矿化诱导后均表达成骨相关基因RUNX2、OCN和成牙相关基因DSPP，但iDPSCs的RUNX2、OCN和DSPP的表达水平低于DPSCs（P＜0．05）；经成脂诱导后两种干细胞均表达成脂相关基因PPARγ，两者的表达水平无显著性差异（P＞0．05）。结论：炎症DPSCs具有良好的增殖能力及多向分化潜能。

炎症；DPSCs；细胞增殖；细胞分化

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：288］

干细胞是人体的起源细胞，具有自我复制、高度增殖和多向分化的能力，按其来源可分为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞（adult stem cells，ASCs）［1］。ASCs存在于发育成熟的组织和器官内，在特定条件下能够按一定的程序分化，并形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。目前，已经从多种组织或器官中分离获得ASCs，如造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSCs）、骨髓间充质干细胞（mesenchymalstem cells，MSCs）、神经干细胞（neural stem cells，NSCs）、肌肉干细胞（muscle stem cells）、成骨干细胞（osteogenic stem cells）等。

DPSCs（dental pulp stem cells，DPSCs）是从牙髓组织中分离获得的一种具有自我更新、多向分化及免疫调节作用的ASCs［2－3］，是组织工程中极具潜力的种子细胞之一。但DPSCs的提取多采用拔牙后提取完整牙髓的方法，取材存在一定的局限性。自从Huang等［4］（2009）首次应用口内拔髓的方法成功分离DPSCs后，炎症DPSCs（inflamed dental pulp stem cells，iDPSCs）因其材料来源广泛、伦理学限制较少、可利用废弃医疗资源等优点越来越引人注目［5］。已有研究发现，iDPSCs具有向成骨／成牙本质、成脂肪、成软骨、成神经等多向分化的潜力［4－8］。但目前对iDPSCs的研究尚处于起始阶段，对其扩增能力和多向分化潜能仍存在争议，临床应用前景仍需进一步的深入研究证实［9］。本实验就iDPSCs的分离培养、增殖与分化能力等进行初步研究，并通过与DPSCs进行比较，以探讨其临床应用的可行性。

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

超净工作台（苏州净化设备厂）；CO2培养箱（Heraeus，德国）；倒置显微镜及照相系统（Olympus，日本）；微孔板分光光度计（Bio－TEK，美国）；流式细胞仪（BD Bioscience，美国）；荧光定量PCR仪（Bio－rad，美国）；DMEM培养基和优等胎牛血清（Gibico，美国）；青霉素和链霉素（华北制药厂）；PE－CD146、PE－CD45、PE－CD34、PE－CD90、PE－CD29、PE－CD105（BioLegend，美国）；RNA提取试剂盒及实时聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（TAKARA，日本）。

1．2 牙髓组织样本来源

炎症牙髓组织3例，来自我科诊断为牙髓炎，且需进行牙髓治疗的上颌前牙或前磨牙（年龄15～23岁）；正常牙髓组织3例，来自因正畸治疗需要而拔除的健康前磨牙或第三磨牙（年龄13～22岁）。所有患者均排除家族遗传病史、慢性感染性疾病史、全身系统性疾病、特殊药物服用史及吸烟史；所有入选牙均排除有牙体、根尖周疾病及牙周病，且近期均未有急性感染。本研究经我医院伦理委员会批准，每位患者均知情同意书。

1．3 方法

1．3．1 iDPSCs和DPSCs的分离、培养

两种牙髓干细胞的分离、培养均采用改良酶消化法。炎症组牙髓的获取采用口内直接拔髓术，首先用洗必泰抗菌液漱口，并用聚维酮碘消毒根管口，然后以无菌拔髓针取牙髓组织；正常组牙髓从完整牙齿中劈开后获得。所取牙髓组织立即转移至超净台内，用含有青、链霉素双抗的0．1 mL／L PBS反复冲洗3～5次后，剪碎牙髓，并加入3 g／LⅠ型胶原酶和2．5 g／L胰蛋白酶各500μL，37℃水浴消化15 min。待组织块呈絮状时，加入含150 mL／L胎牛血清和青霉素、链霉素双抗的DMEM培养液终止消化，并离心（1 000 r／min，10 min）弃上清；沉淀的细胞用DMEM培养液（含150 mL／L胎牛血清和青霉素、链霉素双抗）重悬后接种于6孔板，并置于37℃、50mL／L CO2、饱和湿度条件下进行培养。每2～3 d更换1次培养液，待组织周边有较多的细胞爬出后，挑弃组织块继续培养；当大多数克隆的细胞汇合至80%～90%时，采用有限稀释法克隆分离DPSCs、iDPSCs并进行克隆培养和传代扩增，取对数生长期的第3代和第4代细胞用于后续实验。

1．3．2 DPSCs表面标志物的检测鉴定

分别取生长状态稳定良好的DPSCs和iDPSCs，用预冷的PBS调整细胞密度为1×109／L后，分别用CD146、CD105、CD90、CD29、CD45和CD31标记抗体，并置于4℃下避光孵育30 min；然后用流式细胞仪检测各表面标记物的表达。

1．3．3 MTT法检测两种干细胞的增殖能力

将生长状态稳定良好的iDPSCs和DPSCs，分别以2×103／孔的密度接种于96孔板，常规条件下培养24 h至细胞贴壁后，换液并继续培养。分别于培养1、3、5、7、9 d各时间点，每种细胞各取3孔，并于每孔中各加入20μLMTT（5μg／mL）继续培养4 h；然后弃去培养液，每孔加入150μL DMSO振荡10 min，待结晶完全溶解后，用分光光度计分别测量各孔490 nm波长处的光密度值（OD490）。

1．3．4 两种干细胞克隆形成率（CFU）的测定

将生长状态稳定良好的iDPSCs和DPSCs分别以0．5×103／孔的密度接种于6孔板，各复3孔，常规条件下培养至细胞克隆出现（约2周）后终止培养；吸弃原培养液，并加入甲醇固定15 min后，结晶紫染色15 min；PBS冲净，空气干燥后，计数≥50个细胞的克隆，并按以下公式计算两种干细胞的克隆形成率。克隆形成率（%）＝克隆数／接种细胞数（1×103）×100%。

1．3．5 矿化诱导培养及茜素红染色观察

将生长状态良好的iDPSCs和DPSCs分别以2．5×104／孔的密度接种于6孔板，常规条件下培养至细胞生长汇合达70%～80%时，更换矿化诱导液（含100 mL／L FBS、10 nmol／L地塞米松、10 mmol／Lβ－甘油磷酸钠、50μg／mL维生素C的α－MEM培养基）进行矿化诱导培养，每3 d换液1次。矿化诱导21 d后，茜素红染色，光镜观察矿化结节形成情况并拍照。

1．3．6 成脂诱导培养及油红O染色观察

将生长状态良好的iDPSCs和DPSCs分别以2．5×104／孔的密度接种于6孔培养板，常规条件下培养至细胞生长汇合达70%～80%时，更换成脂诱导液（含 200μmol／mL吲哚美辛、0．5 mmol／mL IBMX、10μg／mL胰岛素、1μmol／mL地塞米松、100 mL／L FBS的DMEM培养基）进行成脂诱导培养，每3 d换液1次。成脂诱导培养20 d后，油红O染色，光学显微镜观察并拍照。

1．3．7 碱性磷酸酶（ALP）活性检测

将生长状态稳定良好的iDPSCs和DPSCs分别以2×103个／孔的密度接种于96孔培养板，常规培养24 h至细胞贴壁后换矿化诱导液继续培养。分别于培养3、5、7 d各时间点，每种细胞各取3孔，吸弃上清并用PBS清洗2遍后，每孔加入50μL 2 mL／L Triton－100继续培养；2 h后加入ALP底物，用分光光度计分别测量各孔450 nm波长处的光密度值（OD450）。

1．3．8 RT－PCR检测各成骨、成脂相关基因的表达

分别收集生长状态稳定良好并经矿化诱导或成脂诱导的iDPSCs和DPSCs，并用RNA提取试剂盒提取RNA。所提取的RNA经核酸蛋白测量仪及琼脂糖电泳检测确定其浓度及纯度后，利用Primescript逆转录试剂盒反转录合成cDNA；然后以cDNA为模板，β－actin为内参照，用荧光实时定量PCR检测两种干细胞中成牙相关基因DSPP、成骨相关基因RUNX2、OCN和成脂相关基因PPARγ，并根据所测得的Ct值，以2－ΔΔCt方法计算各待测基因的相对表达量。PCR反应体系、反应条件均严格按试剂盒说明；所用引物由上海生工合成，各引物序列见表1。

表1 RT－PCR引物序列

1．4 统计学分析

使用R软件（version 3．0．3）进行统计学分析，两组独立样本均数（±s）比较用t检验，检验水准α＝0．05。

2 结果

2．1 DPSCs原代培养

炎症组和正常组各3例牙髓组织均培养成功，镜下可见组织块贴壁后1 d即有细胞爬出；换液继续培养后，炎症组至10 d左右、正常组至8 d左右细胞汇合均达80%～90%，贴壁细胞多呈梭形或多角形的成纤维样细胞，且胞体伸展良好、胞浆均匀、核圆、核仁清晰（图1）。

2．2 DPSCs表面标志物的表达

流式细胞仪检测结果显示，iDPSCs和DPSCs两种来源的DPSCs均阳性表达CD146、CD105、CD90和CD29，而对造血系标志物CD45及内皮系标志物CD31均不表达。两种干细胞对各表面标志物的表达无显著差异（P＞0．05）（图2）。

图1 iDPSCs和DPSCs在不同时间的形态（倒置显微镜×10）

图2 iDPSCs、DPSCs流式细胞仪检测结果

2．3 两种干细胞的增殖能力和克隆形成能力比较

通过MTT检测结果绘制细胞生长曲线并进行分析显示，iDPSCs的增殖能力与DPSCs相比无显著差异（P＞0．05）（图3）。在单克隆形成率方面iDPSCs为0．58±0．06，DPSCs为0．56±0．04，两种干细胞之间无显著性差异（P＞0．05）；但iDPSCs形成的克隆略小于DPSCs（图4）。

图4 iDPSCs与DPSCs细胞克隆形成肉眼观及细胞克隆数比较

2．4 两种干细胞成骨／成牙和成脂分化潜能的比较

矿化诱导21d后iDPSCs和DPSCs均呈复层生长，部分细胞聚集成圆形结节状，经茜素红染色后，均可见红染的圆形矿化结节，但iDPSCs的矿化结节小于DPSCs（图5）；ALP检测结果显示，两种干细胞的ALP活性均随着矿化诱导时间的延长而逐渐升高，但在各培养时间点两组细胞之间的ALP活性均无显著性差异（P＞0．05）（图6）；RT－PCR检测结果显示，两种干细胞均表达成骨相关基因RUNX2、OCN和成牙相关基因DSPP，但iDPSCs的RUNX2、OCN和DSPP表达水平均明显低于DPSCs（P＜0．05）（图7）。成脂诱导至20d后iDPSCs和DPSCs均有小泡聚集而成的脂滴形成，油红－O染色均呈阳性反应（图8）；RT－PCR检测结果显示，两种干细胞均表达成脂相关基因PPARγ，两者的表达水平无显著性差异（P＞0．05）（图7）。

图5 iDPSCs与DPSCs矿化诱导21d后茜素红染色（10×）

图6 iDPSCs与DPSCs矿化诱导后ALP活性比较

图7 iDPSCs与DPSCs细胞分化相关基因的表达水平比较

图8 iDPSCs与DPSCs成脂诱导20d后油红O染色（10×）

3 讨论

炎症iDPSCs是从炎症牙髓组织中提取的具有类似正常DPSCs特性的间充质干细胞，有研究证实从恒牙炎症牙髓中分离获得的干细胞具有向成骨／成牙本质分化、成脂肪、成神经等分化的潜力［4－8］。虽然目前对iDPSCs的扩增能力和多向分化能力仍存在争议，但不可否认的是iDPSCs在牙髓再生中具有重要的作用，使得原本因治疗需要被“废弃”的炎症牙髓组织焕发出了新的价值，从而为牙髓再生的研究提供了新的思路。

由于临床操作、材料来源等条件的限制，一般对于iDPSCs的提取都采用口内直接拔髓术获取组织样本［4－5］。但口内取材时样本容易被细菌污染，故本实验通过拔髓操作前洗必泰抗菌液漱口、PBS反复冲洗牙髓，同时配合使用可作用于G＋和G－细菌的青霉素和链霉素［10］，从而有效避免了细胞培养物的细菌污染。

国际细胞治疗学会指出，间充质干细胞的一个重要特征是阳性表达间充质表面标志物［11］。本实验应用流式细胞仪对炎症牙髓来源的干细胞表面标志物进行鉴定并与正常牙髓来源的干细胞进行了比较，结果显示iDPSCs和DPSCs均阳性表达CD146、CD105、CD90和CD29等干细胞标志物，而对造血系标志物CD45及内皮系标志物CD31均不表达。两种干细胞相比，各标志物的表达强度均无显著性差异（P＞0．05），与Perieira等［6］、Wang等［8］的研究结果相同。

原代培养时，细胞单克隆的形成被认为是成功分离干细胞的重要特征之一［5］。本实验通过有限稀释法从炎症和正常牙髓中成功的获得了iDPSCs和DPSCs，两种干细胞的形态均为成纤维细胞样的长梭形，且在细胞增殖能力和单克隆形成数／率方面二者均无显著性差异（P＞0．05），虽然和Pereira等［6］的结果相同，但与Wang等［8］报道的炎症牙髓细胞单克隆形成数／率显著小于正常牙髓组的结果不同。而Huang等［4］的结果显示炎症牙髓细胞单克隆形成数／率与正常牙髓组无差异，但第3代到第7代iDPSCs的扩增率均要高于对应代数的正常DPSCs组。造成以上不同结果差异的原因，我们推测可能与DPSCs供者的年龄、机体状况、供牙牙龄的不同，以及iDPSCs和DPSCs之间生物学特性的差异有关，今后仍需进一步深入的研究。

Alongi等［5］发现，iDPSCs的多向分化能力弱于DPSCs；Saha［12］、Kim等［13］发现，iDPSCs的成骨／成牙本质、成软骨能力弱于正常牙髓组，成脂肪能力强于正常牙髓组。但是Wang［8］和Pereira等［6］的研究表明，iDPSCs的多向分化能力与DPSCs无明显差异。在本实验中，我们比较了iDPSCs与DPSCs在诱导分化后的成骨／成牙和成脂相关基因的表达水平，结果显示，经矿化诱导后iDPSCs成牙和成骨相关基因的表达水平均明显低于DPSCs（P＜0．05）；经成脂诱导后iDPSCs的成脂相关基因的表达水平与DPSCs相比无显著性差异（P＞0．05），说明本实验获得的iDPSCs具有一定的向成骨／成牙本质细胞、成脂细胞分化的能力，但其成骨／成牙本质能力低于DPSCs，成脂能力无差异。

以上结果提示，iDPSCs作为一种更容易取材的ASCs具有良好的增殖能力及多向分化潜能，可在临床上应用于牙本质－牙髓再生和组织工程等再生医学领域［14－16］。但iDPSCs的成牙本质和成骨分化潜能低于DPSCs，其具体原因和机制仍有待于进一步研究。

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Com parison of the properties of the stem cells isolated from normal and inflamed dental pulps

GUAN Li－na*，HE Ying，HAN Bing，SUN Xue－fei，YANG Fan
（*State Key Laboratory of Military Stomatology Department of Operative Dentisty＆Endodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi＇an 710032，China）

AIM：To compare the properties of stem cells isolated from normal and inflamed dental pulps．METHODS：Dental pulp stem cells from inflamed（iDPSCs）and normal pulps（DPSCs）were cultured，purified and expanded．Cell proliferation，colony formation rate，cell surface specific markers and cell differentiation－related genes were then determined after expansion．RESULTS：CD146，CD105，CD90 and CD29 were positively expressed，but CD45 and CD31 were notexpressed in both stem cells．Therewere no significant differences in cell surface specificmarker expression，cell growth and colony formation rate between the two groups（P＞0．05）．RT－PCR analysis showed that the expression of RUNX2，OCN and DSPP of iDPSCs were weaker than that of DPSCs（P＜0．05），but no significant difference was displayed in the expression of PPARγ（P＞0．05）．CONCLUSION：Themorphology，proliferation rate and differentiation potential of iDPSCs are similar to those of DPSCs．

inflammation；dental pulp stem cells；cell proliferation；cell differentiation

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0288－07

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．006

2014－10－28；

：2015－03－01

国家自然科学基金资助项目（81070803，81170930）

陕西省国际合作课题（2011KW－40）

关丽娜（1974－），女，锡伯族，新疆乌鲁木齐人。硕士生（导师：杨帆）

杨 帆，E－mail：yangfan＠fmmu．edu．cn