NLRP3炎症体在小鼠实验性急性牙髓炎中的表达

王培娜，王海婧，蒋文凯，贾 谦，倪龙兴

（军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科，陕西西安710032）

·基础研究·

NLRP3炎症体在小鼠实验性急性牙髓炎中的表达

王培娜，王海婧，蒋文凯，贾 谦，倪龙兴

（军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科，陕西西安710032）

目的：了解NLRP3炎症体在小鼠牙髓组织中的表达情况。方法：将40只C57BL／6J小鼠随机分为对照组及开髓6、12、24 h组（n＝10），开髓组（牙髓炎模型组）采用单纯髓腔开放法建立小鼠急性牙髓炎模型，并在相应时间点处死小鼠后取材，常规组织学处理后，HE染色观察牙髓炎症状况，免疫组化染色检测NLRP3在小鼠正常和炎性牙髓组织中的表达及定位。结果：HE染色观察见牙髓炎模型组小鼠牙髓呈现急性炎性反应。免疫组化染色发现，小鼠正常牙髓组织NLRP3仅表达在成牙本质细胞；而在炎性牙髓组织NLRP3在成牙本质细胞和牙髓成纤维细胞均呈阳性表达。结论：NLRP3在小鼠牙髓组织中表达并可能在急性牙髓炎的发生发展中起重要作用。

NLRP3；牙髓炎；小鼠；免疫组化

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：259］

机体的自我防御系统包括固有免疫（inherent immunity）和获得性免疫（acquired immunity）两种机制，当细菌及其代谢产物等病原微生物侵入机体组织时，其固有免疫系统作为防御侵害的第一道屏障发挥着至关重要的作用。“炎症体（Inflammasome）”是固有免疫系统的重要组成部分，能够快速识别各种病原微生物，从而发挥免疫防御作用。NLRP3炎症体是NLRs（nucleotide－binding oligomerization domain－like receptors，NLRs）家族中研究比较深入的一种炎症因子，它是Caspase活化时的反应平台，而活化的Caspase－1通过调控下游分子IL－1β和IL－18的成熟和分泌［1］，进而参与机体的炎症反应。牙髓组织作为机体的一部分，是否遵循机体的固有免疫机制，通过NLRP3炎症体来感知微生物并对其产生防御反应，是我们亟需研究的一个课题。本实验通过建立小鼠实验性急性牙髓炎模型，观察NLRP3在小鼠牙髓组织中的表达及定位，了解NLRP3在牙髓炎发生发展过程中的作用，以期为牙髓炎的治疗提供新的理论依据和思路。

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

40 g／L水合氯醛（分析纯AR，上海山浦化工有限公司）；40 g／L多聚甲醛（AR－0211，北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；兔抗小鼠NLRP3抗体（sc－66846，Abcam公司，美国）；免疫组化试剂盒（SV0002，武汉博士德）；实验动物称量用电子秤（DST671，苏州市苏杭科技器材有限公司）；牙科高速涡轮机（TC－169，上海市通用齿材设备电子有限公司）；牙科手机（PANA－AIR－S－M4，NSK，日本）；体视显微镜（SXP－1C，上海医光仪器有限公司）；组织脱水机（TS－12U）、组织包埋机（BM－IX）、温控捞片机（CS－VI）（孝感宏业医用仪器有限公司）；石蜡切片机（RM2235，Leica，德国）；正置显微镜成像系统（BX－43，Olympus，日本）。

1．2 实验动物和分组

选取6周龄C57BL／6小鼠（体质量20～25 g，雌雄各半，共40只（购于第四军医大学实验动物中心）。随机选取30只为炎症模型组，另外10只为正常对照组。炎症模型组按髓腔开放时间分为6、12、24 h组（n＝10）；正常对照不作开髓处理。

1．3 小鼠牙髓炎模型的建立和取材

炎症模型组30只小鼠以40 g／L水合氯醛按0．01mL／g腹腔注射麻醉后，仰位固定于小动物实验台，用眼科镊撑开小鼠口腔，暴露上颌磨牙，以750mL／L乙醇消毒上颌磨牙。体视显微镜下用装有1／4圆钻的高速涡轮机在小鼠右侧上颌第一、二磨牙牙合面不喷水钻磨，待有透红点时停止磨切，用金属探针在透红点加压，形成穿髓孔后开放髓腔不作其他处理。实验组小鼠分别在建模后6、12、24 h脱颈处死，然后将上颌第一、二、三磨牙连同部分上颌骨一并取材。正常组在建模前处死取材。

1．4 牙髓组织切片的制作和染色观察

将标本置于40 g／L多聚甲醛中固定24 h，经170 g／L EDTA脱钙20 d后流水冲洗1 h；然后将其置于脱水机中逐渐脱去组织中的水分，再将组织块置于二甲苯中透明；经透明处理后的组织块置于融化的石蜡中，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。制作5μm厚的石蜡切片，行苏木精－伊红（HE）染色，光镜观察。

1．5 免疫组化染色

制作3μm厚石蜡切片，常规脱蜡，梯度乙醇脱水，PBS冲洗3 min×3次；3 mL／L甲醇－H2O2室温孵育15 min以封闭内源性过氧化物酶，PBS冲洗3min×3次；1 g／L胰蛋白酶37℃孵箱消化30min以暴露细胞内抗原，PBS冲洗3min×3次；100 mL／L胎牛血清封闭30 min后滴加NLRP3（1∶100）一抗，37℃湿盒中2 h，4℃过夜，PBS冲洗3min×5次；滴加山羊抗兔二抗（1∶200），37℃避光孵育30 min，PBS冲洗3 min×5次；DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，显微镜下观察NLRP3阳性细胞。阴性对照组用PBS缓冲液代替一抗，其他同前所述，观察正常和炎症牙髓组织中NLRP3的表达。

2 结果

2．1 组织学观察

小鼠右侧上颌第一、二磨牙牙髓组织的HE切片显示，正常对照组：牙髓腔内牙本质细胞层细胞排列正常，胞质均匀淡染，炎症细胞极少；炎症模型组：穿髓点下方可见中性粒细胞浸润，随着开髓时间的延长，牙髓组织炎症逐渐加重，牙本质细胞层细胞排列紊乱，牙髓血管扩张充血，血管周围红细胞外渗，冠髓可见少许坏死组织（图1）。

2．2 免疫组化观察

根据HE染色结果选择牙髓炎特征比较明显的12 h为代表进行免疫组化染色，结果显示，正常小鼠牙髓组织：NLRP3蛋白在成牙本质细胞中呈阳性表达，而在牙髓成纤维细胞中表达极少，阴性对照组各类细胞中均无NLRP3表达；炎性牙髓组织：排列紊乱的成牙本质细胞及多种炎症细胞中NLRP3均呈阳性表达，炎性病灶周边的牙髓成纤维细胞中亦表达NLRP3，而阴性对照组各类细胞均无NLRP3表达（图2）。

图1 对照组及炎症模型组小鼠牙髓组织病理学观察（HE，×200）

图2 小鼠牙髓组织中NLRP3的表达

3 讨论

牙髓炎是由于牙髓组织受到细菌感染或物理、化学因素的刺激而发生的一种炎症性病变［2］。作为口腔常见病和多发病，到目前为止其发生、发展及转归过程中仍有很多问题尚不清楚，建立一种有效的动物模型是牙髓炎研究的重要基础。以往的牙髓炎模型多选用在生物进化、组织结构及器官形态功能与人类较为接近的猴、狗、小型猪等动物，也有选择兔、猫、大鼠等小型动物作为实验对象，均取得了成功。而小鼠因其体积小、口内空间狭窄、操作困难等缺点，很少用于牙髓炎动物模型的构建。然而作为基因敲除技术的重要载体，小鼠在牙髓炎的研究中有其他动物无法替代的作用，因此建立小鼠实验性牙髓炎模型有着积极的意义。

根据小鼠磨牙小的特点，本实验利用体视显微镜进行单纯髓腔开放法构建小鼠实验性牙髓炎模型。HE切片结果显示：正常组牙髓组织中鲜有炎症细胞，而开髓后6 h组在开髓口附近可见炎症细胞增多；随着时间的推移，12、24 h组炎症反应明显加重，牙髓血管充血扩张，牙本质细胞排列紊乱。基于上述病理变化，我们认为构建小鼠实验性牙髓炎模型是一种可行的方法，为后续研究提供了可靠的动物模型。

真核生物具有复杂的免疫识别系统，其对病原体的识别主要依赖于病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）的受体介导，这些受体称为模式识别受体（pattern recognion receptor，PRR）［3］。在固有免疫反应中，正是通过PRR对PAMPs的识别来抵抗病原微生物的入侵，为机体的防御筑起了第一道防线［4－5］。研究发现，NLRs由N端的效应结构域（CARD、PYD和BIR）、C端的亮氨酸重复序列结构域（LRR）和中间部分的核苷酸寡聚化结构域（NACHT）构成，是细胞内PRR中一个很大的蛋白家族［6］。能够识别胞内菌等细胞内危险信号分子［7－8］，并参与不同信号通路的激活［9－10］，从而促进炎症因子的产生，启动机体固有免疫应答。Martinon等［11］研究发现具有NACHT、LRR、PYD结构域的蛋白与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）能够形成一个多蛋白复合体，称为“炎症体”，而通过形成炎症体发挥作用的分子主要有4个（NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM－2），其中NLRP3炎症体是目前研究最多也最为明确的一个炎症体。

本实验结果显示，正常小鼠牙髓组织中，成牙本质细胞中NLRP3呈阳性表达，牙髓成纤维细胞中NLRP3几乎不表达；而在炎性牙髓组织中，排列紊乱的成牙本质细胞及多种炎症细胞均有NLRP3表达，炎性病灶周边的牙髓成纤维细胞亦表达NLRP3。该结果进一步证实当病原微生物侵入牙髓组织时，非免疫的牙髓成纤维细胞活化，分泌炎性细胞因子，参与免疫应答反应［12］。而病原微生物及其产物是否通过NLRP3影响成牙本质细胞，并进一步参与反应性牙本质的形成，以及成纤维细胞如何被活化尚需深入研究。

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［12］Song Z，Lin Z，He F，et al．NLRP3 is expressed in human dental pulp cells and tissues［J］．J Endod，2012，38（12）：1592－1597．

Expression of NLRP3 inflammasome in experimental acute pulpitis in m ice

WANG Pei－na，WANG Hai－jing，JIANGWen－kai，JIA Qian，NILong－xing
（State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Operative Dentistry and Endodotics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To investigate the expression of NLRP3 inflammasome in dental pulp tissues of experimental acute pulpitis inmice．METHODS：40C57BL／6Jmice were randomly divided into 4groups（n＝10）．Themice in control group received no treatment．The dental pulps of themice in other 3 groupswere exposed for 6，12 and 24 h，respectively．At different time points，the animalswere sacrificed and pulp tissueswere examined by HE staining．NLRP3 expression was observed by immunohistochemical staining．RESULTS：HE staining revealed acute inflammation in the pulp of experimentalmice．NLRP3 was detected in the cytoplasm of odontoblasts in normal dental pulps．In the inflammatory pulp tissues，both odontoblasts and fibroblasts expressed NLRP3．CONCLUSION：NLRP3 is expressed in the normal and inflammatory pulp tissues，and possibly plays an important role in the development of pulpitis．

NLRP3；pulpitis；mice；immunohistochemistry

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0259－04

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．001

2014－12－26；

：2015－02－28

国家自然科学基金资助（81170946，81371139）

王培娜（1988－），女，汉族，河北邯郸人。硕士生（导师：倪龙兴）

倪龙兴，E－mail：nilongx＠fmmu．edu．cn