血清N-乙酰天门冬氨酸与早期神经系统变性疾病的相关性研究*

沈小平 王士列 刘建平 李年春 郑团圆 刘煜帆

神经变性病（Neurodegenerative Diseases）是指由于神经元变性、凋亡所导致的神经系统退行性疾病，是一组原因不明的中枢系统疾病，他们可能具有相类似的发病机制[1-2]。随着老龄化日趋严重，神经变性疾病的发病率逐渐升高。2007年我国60岁以上人口已达1.49亿，其中80岁以上者有1600万。预计2040年60岁以上的人口将达到3.97亿，80岁以上的老人将达到1亿。阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）是老年人中发病率居于前2位的神经变性疾病，65岁以上AD的患病率为5%，70岁以上为10%，80岁以上则高达30%；65岁以上PD的患病率为1%，随年龄增加而升高。AD和PD已成为严重危害老年人身心健康、增加家庭和社会负担的神经系统重大疾病。目前这类疾病的早期诊断仍十分困难，可能的手段包括功能影像学、分子遗传学检查等，这些检查设备、技术要求高，难以作为疾病早期筛查手段应用于临床。N-乙酰天门冬氨酸（N-acetyl aspartic acid，N-AA）是神经系统的特定代谢产物，通常被作为脑内神经元变化的一个标志物。本研究以AD、PD患者及正常老年人作为研究对象，通过检测其血清NAA含量，并联合颅脑磁共振波谱（MRS）测定其脑内NAA含量，研究患者血清NAA及脑内NAA的变化是否具有一致性。进一步探讨血清NAA与早期神经系统变性疾病的相关性；建立一种简单、快速、经济的神经系统变性疾病的筛查手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2014年1月-2015年1月住院及门诊的AD患者30例，符合2011年美国NIA/AA阿尔茨海默病诊断标准中很可能AD的诊断标准；PD患者30例，符合2006年《中华神经科杂志》发表的中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组制定的帕金森病的诊断标准。另选择同时期门诊体检的健康老年人30例。所有入选者均排除有脑白质疏松、脑卒中、脑外伤、脑炎、肿瘤、多发性硬化、偏头痛、癫痫等各种脑损伤者。三组年龄、性别及受教育年限比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。

表1 三组年龄、性别及受教育年限比较

1.2 方法

1.2.1 血清NAA的测定 取早晨空腹静脉血5 mL，室温凝固后收集血清，-80 ℃冰箱保存备用。血清NAA测定采用气相色谱-质谱联用仪测定。方法如下：（1）以NAA标准品建立保准曲线。（2）确定气相色谱质谱条件。（3）精密度试验：用变异系数（CV）表示精确性。在上述色谱条件下，取低、中、高浓度混合标准品的血清样本进行批内和批间精密度实验。（4）回收试验：取正常空白血清样品100 μL，分别加入10、100和1000 μg/mL NAA标准品各100 μL，配成低、中、高三种浓度的溶液，采用上述色谱条件进行上机分析。（5）定量下限：当信噪比S/N=10时，测得该方法检测NAA的定量下限。

1.2.2 脑内NAA检测 采用1H-MRS检查。通过常规MRI扫描，应用点解析频谱序列（point resolved spectroscopy，PRESS）来获得三维波谱化学位移成像图（3D-CSI），感兴趣区（ROI）为双内侧颞叶及海马区。自动预扫描程序完成发射或接受增益调节、体素内匀场、水抑制和无水抑制扫描。磁共振扫描仪自带软件自动完成基线校准、信号平均，识别并计算各代谢物波峰曲线下面积。不同化合物中原子核的化学位移不同，根据磁共振波谱中其共振峰（化学位移）的位置不同可加以鉴别。化学位移的大小以磁共振频率的百万分之一（ppm）表示，MR波谱中以横坐标来表示，纵坐标代表代谢产物的信号强度单位。与神经系统疾病相关的主要代谢物的化学频移位置为：N-乙酰天门冬氨酸（NAA）2.01 ppm、肌酸（Cr）3.03 ppm、肌醇（mI）3.56 ppm。并能自动给出以Cr为参照的各种代谢物信号强度的比值（NAA/Cr、NAA/mI）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，计量资料以（x-±s）表示，两组比较采用t检验，三组比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组双内侧颞叶代谢物浓度的比较 双内侧颞叶NAA的含量为NC组>PD组>AD组，而血清NAA含量刚好相反，代谢物比值NAA/Cr、NAA/mI及血清NAA三组间比较差异均有统计学意义（P<0.05），其中AD组与PD组两组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.2 三组双侧海马区代谢物浓度的比较 三组双侧海马区NAA的含量为NC组>PD组>AD组，而血清NAA含量AD组>PD组>NC组（P<0.05），AD组与PD组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表2 三组双内侧颞叶NAA浓度与血清NAA的比较（±s）

表2 三组双内侧颞叶NAA浓度与血清NAA的比较（±s）

*与NC组比较，P<0.05

组别 NAA/Cr（L）NAA/Cr（R）NAA/mI（L）NAA/mI（R）血清NAA NC 组（n=30）2.01±1.01 1.59±0.40 7.80±2.01 6.76±2.12 0.085±0.013 AD 组（n=30）1.28±0.90* 1.68±1.35* 3.91±2.13* 3.78±2.14* 0.102±0.016*PD 组（n=30）1.30±0.80* 1.71±0.92* 4.14±2.12* 3.49±2.08* 0.980±0.012*P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

表3 三组双侧海马区NAA浓度与血清NAA的比较（±s）

表3 三组双侧海马区NAA浓度与血清NAA的比较（±s）

*与NC组比较，P<0.05

组别 NAA/Cr（L）NAA/Cr（R）NAA/mI（L）NAA/mI（R）血清NAA NC 组（n=30）1.50±0.40 1.74±0.46 2.80±0.76 2.82±1.08 0.085±0.013 AD 组（n=30）1.06±0.28* 1.23±0.34* 1.16±0.48* 1.48±0.80* 0.102±0.016*PD 组（n=30）1.26±0.30* 1.34±0.42* 1.86±0.82* 1.74±0.78* 0.980±0.012*P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

3 讨论

3.1 磁共振波谱分析脑内NAA的浓度变化 近来研究发现神经变性病具有共同特征，各种类型除了受损部位不同之外，组织病理学均显示神经细胞染色变淡、萎缩、胞体表面不平、细胞核固缩或碎裂、胞浆内虎斑溶解、细胞突减少、突触水肿或萎缩。神经变性病大多在神经细胞内有包涵体存在，例如，PD和额颞型痴呆的Lewy小体、AD的平野Hirano小体、Pick病时的Pick小体及肌萎缩侧索硬化的Bunina小体等包涵体。这些小体形态大致相似，这些小体也都是细胞内各种不同类型蛋白质的异常聚集所致，包括突触核蛋白、磷酸化tau蛋白、淀粉样蛋白及泛素化蛋白等。目前已发现神经变性病的发病大多有以下共同因素有关：遗传基因突变线粒体能量代谢缺陷，活性自由基分子生成过多，兴奋性氨基酸释放过度，钙离子通道开放和钙离子内流，以及蛋白质转录后修饰异常和神经营养因子供应不足等[3]。本课题研究发现，颅内双内侧颞叶及海马区AD组和PD组NAA/Cr、NAA/mI均明显低于NC组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。这与AD患者的磁共振波谱变化具有一致性；AD患者出现这种特征性的波谱改变的原因可能有：AD患者脑内老年斑形成与神经原纤维缠结引起NAA的缺乏，同时伴有神经胶质细胞的增生导致mI的过剩；AD患者内侧颞叶及海马等结构，出现神经元的广泛脱失，引起NAA降低，同时伴有胆碱能、肾上腺能和5-羟色胺能递质系统障碍，毒蕈碱样胆碱能受体和α-肾上腺能受体激活时多伴有磷酸肌醇的水解，为了维持受体的功能必须加速肌醇等物质再合成磷脂酰肌醇的过程，因而患者脑内mI水平较高，1H-MRS测量NAA值降低[4-8]。既往学者Schuff等[9]研究发现：利用1H-MRS和MRI研究36~85岁年龄段的24例健康成年人的海马代谢物及其体积的变化，发现NAA/肌酸（Cr）的比例下降了26%，海马体积缩小了20%。这表明NAA的水平在正常老年人也有所下降。因此，MRS可通过测定脑组织内多种微量代谢物的含量来分析局部组织代谢的改变，尤其适用于神经系统生化及代谢变化的研究。

3.2 血清NAA与脑内NAA的关系 NAA是神经系统的特定代谢产物，由天门冬氨酸和乙酰辅酶A在神经元线粒体中合成的[10]，是人脑中最集中的神经肽，正常情况下，NAA的清除是从神经元到少突胶质细胞的转移，当发生病理改变的时候，损伤的神经元中NAA的释放会增加，此时NAA首先进入星形胶质细胞并进入血液循环[11-13]。本研究发现NC组血清NAA较AD组和PD组患者的血清NAA明显升高，具有统计学意义（P<0.05），同时也发现血清NAA与脑内NAA呈负相关。Simone等[14]研究发现肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者血清NAA的水平明显高于正常对照者，高水平的NAA与ALS的临床表现密切相关；也有学者在多发性硬化（MS）患者中，脑NAA的MRS显示NAA降低，而血清NAA浓度升高[15]，而健康人群中，血清NAA浓度与年龄、性别无显著相关性[16]。提示脑内神经细胞损害后NAA可能释放到体液中，所以血清NAA浓度升高可能反映出脑内NAA下降。血清中NAA的测定有可能作为神经变性病患者的一种排除性诊断手段。

对于临床前期AD、PD患者，他们都是痴呆的高危人群，对这些人群进行早期诊断和干预，有效地遏制或延缓疾病的进展，对社会及患者家庭都具有重大意义。目前，AD等神经变性病早期诊断的研究主要聚焦于颅脑影像学及体液生物学标记，其中血液生物学标记物如血浆B淀粉样蛋白及其相关抗体、胞外B淀粉样蛋白分子伴侣等有望用于AD的早期诊断。血液生物标记因样本获取简便，与疾病的病理过程联系紧密，诊断敏感性及特异性较高，可能成为今后神经变性病的早期生物学标记研究的热点。

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