低钾胁迫对烟草幼苗碳氮代谢基因表达谱的影响

鲁黎明，陈 勇，鲁逸飞，李立芹

（四川农业大学农学院，成都 611130）

低钾胁迫对烟草幼苗碳氮代谢基因表达谱的影响

鲁黎明，陈 勇，鲁逸飞，李立芹*

（四川农业大学农学院，成都 611130）

为探索烟草响应低钾胁迫的分子机制，对K326烟草幼苗进行了0、6、12和24 h的低钾胁迫处理，并利用定制的烟草全基因组芯片，分析了烟草幼苗基因表达谱的变化。结果表明，与0 h相比，6、12和24 h的3个时间点差异表达在2倍以上（p＜0.05）的基因总数为3790个。从功能方面看，这些差异表达基因广泛参与了烟草的各种生物学过程，包括抗氧化活性、应激反应、运输活性、发育过程、催化活性、生物调节、代谢过程等。其中包括了硝酸还原酶基因NIA2等10个参与烟草氮代谢的基因，以及UGP等44个参与烟草碳水化合物与糖代谢的基因。本研究结果说明，低钾胁迫对烟草的基因表达产生了广泛的影响，进而可能影响到烟草的碳氮等基础代谢。

烟草；低钾胁迫；基因表达谱；基因芯片；碳氮代谢

钾是烟草的一个重要品质元素。然而，与国外优质烟叶相比，我国烟叶中的钾含量较低［1-2］。研究表明，由于植物生长对钾的需求量较大，土壤中含钾量往往不足以满足植物生长发育的需要［3］。为适应这种低钾环境，植物产生了一整套调节机制，如功能基因的诱导表达［4-9］、信号转导与调节途径的运作［10-11］。近年来，基因芯片技术以其高通量、全方位的特点，在植物响应非生物胁迫的机制研究方面得到了广泛的应用［12］。如拟南芥［13-15］及水稻［16-20］分别响应低氮、低磷的研究均表明，在胁迫条件下，拟南芥及水稻的基因表达谱均发生了较大的变化。其中，Ma等［11］对水稻响应低钾胁迫的研究证实，编码碳氮代谢、信号蛋白、转录因子及矿质元素转运蛋白的基因，均参与了这种胁迫响应。在烟草的生长发育后期，也经常遇到土壤中有效钾含量不足的问题。所以，探索烟草响应低钾胁迫的分子机制，对于提高烟叶钾含量具有重要的意义。因此，本研究利用基因芯片技术，分析低钾胁迫下烟草参与碳氮代谢的基因表达谱的变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

试验材料为烤烟品种K326（Nicotiana tabacum cv. K326），基因芯片为美国安捷伦公司烟草全基因组芯片。

烟草种子表面消毒后，播种于MS培养基上，并放于光照培养室进行全光照培养，培养温度为28 ℃。无菌苗培养4周后，进行低钾胁迫处理（0、6、12和24 h），重复3次。将烟草幼苗移到低钾培养基［21］上，并在上述4个时间点进行取样，迅速于液氮中冷冻备用。

1.2 基因表达谱芯片分析

烟草样品总RNA的抽提采用TRIZOL法，按照试剂盒说明书的要求进行。使用QIAGEN RNeasy® Kit 纯化总RNA。然后，使用Nanodrop ND-1000及Agilent BioAnalyzer 2100进行总RNA质检。

芯片杂交：cDNA的合成、cRNA的制备、Cy3单色荧光标记、标记产物的片段化等均按照美国安捷伦公司的基因芯片杂交标准流程进行。芯片杂交过程与数据采集由上海伯豪生物技术有限公司芯片杂交平台完成。

1.3 数据处理与分析

基因表达信号经归一化后，各处理与对照信号值进行比对，若foldchange变化的比值≥2为该基因表达上调，比值≤-2.0则该基因表达下调，以此筛选出每组对比中的差异表达基因。登陆上海伯豪生物公司的SAS分析系统（http://www. shanghaibiotech.com）进行数据分析，并对差异表达基因进行GO（Gene Ontology）功能分析。

Cluster聚类分析使用Cluster3.0软件进行。差异基因的表达趋势分析采用STEM（Short Timeseries Expression Miner）软件进行。

1.4 RT-qPCR验证

随机挑选出3个上调表达和3个下调表达基因作为验证基因，引物采用primer 3.0软件进行设计，由生工生物工程有限公司合成。RT采用Invitrogen的反转录试剂盒，按照说明书进行。SYBR Green qPCR采用10 μL反应体系（2×SYBR Green PCR buffer 5ul，正反向引物各0.2 μL，模板DNA 5 ng，用ddH2O加至10 μL），反应条件为95 ℃，5 min，95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，40个循环。

2 结 果

2.1 差异表达基因总体特征

利用上海伯豪生物公司的SAS分析系统，对芯片数据进行了分析。以P＜0.05且变化倍数在2倍以上为条件，梳理了差异表达的基因。3个时间点共计富集到3790个差异表达基因（DEGs）。与0 h相比，6 h时间点差异表达基因达2277个，其中，上调表达1270个，下调表达1007个；12 h为1954个，其中，上调表达1159个，下调表达795个；24 h为1835个，其中，上调表达1023个，下调表达812个。6 h时间点差异表达基因数量较多，同时，在3个时间点，上调基因的数量总是比下调基因多。在上调表达的DEGs中，3个处理时间点一直都处于上调的基因有300个；在下调表达的DEGs中，3个处理时间点一直都处于下调的基因有257个，共计557个。该类基因在低钾胁迫后一直处于活跃状态，可能与低钾胁迫有着密切的联系。

差异表达基因可以分为8种表达趋势（图1，A-H），趋势中各基因的表达一致性较强，变化动态较一致。这些表达趋势相似的基因，可能在某些生理生化过程中处于协同关系，或者具有类似的功能。

2.2 RT-qPCR验证

为检验基因芯片检测结果的准确性，在差异表达基因中，随机挑选了3个上调和3个下调基因作为验证基因，进行RT-qPCR的验证。结果表明基因芯片技术对基因表达检测的准确性较高。

图1 烟草响应低钾胁迫的基因表达模式分析Fig. 1 Expression profiles of tobacco seedlings under potassium deficiency

2.3 差异表达基因的功能分析

在P（0.05）显著水平下，这些差异表达基因可以归纳为18种功能，如抗氧化活性、结构分子活性、电子载体活性、应激反应等（图2）。说明低钾胁迫引发了烟草幼苗多种生理生化反应。

表1 RT-qPCR所用引物Table1 Primers for RT-qPCR

2.4 氮代谢过程相关基因

氮代谢是植物体内的基础代谢过程，直接影响着植物的生长发育，也是植物产量形成的主要影响因素［22-24］。在本研究中，低钾引起了氮代谢过程中的相关基因的变化（表2）。如硝酸还原酶NIA2、谷氨酸合成酶GLT1、谷氨酰胺合成酶AtGSR1等。这些基因均集中于植物氮代谢的起点，即无机氮同化为有机氮的过程。

图2 差异表达基因的功能分析Fig. 2 GO analysis of DEGs

表2 氮代谢途径中的重要基因Table 2 Nitrogen metabolic genes

2.5 碳水化合物代谢相关基因

碳水化合物及糖类代谢是植物的最基本的初生代谢，直接影响着植物的基本生命活动［25-26］。本研究发现，在低钾胁迫下，烟草幼苗参与碳水化合物代谢的基因中，有44个基因的表达发生了显著变化，其中上调28个，下调16个（表3）。这些差异表达基因主要参与了光合作用碳同化、呼吸作用之糖酵解与PPP途径、蔗糖合成以及淀粉代谢等生化过程。本结果说明，低钾胁迫可能导致了烟草幼苗光合作用与呼吸作用发生改变。

3 讨 论

3.1 低钾对氮代谢的影响

本试验结果表明，低钾胁迫导致了烟草编码硝酸还原酶、谷氨酸合成酶与谷氨酰胺合成酶等基因的表达均发生了明显变化。此结果与拟南芥及水稻的研究结果相一致［10-11］。在本研究中，硝酸还原酶基因的表达在3个时间点均处于下调，而谷氨酰胺合成酶基因则均上调表达。由于这些基因在根部参与无机氮同化过程，因此，可以推测，在外界环境缺钾时，烟草氮同化会受到抑制，从而可能会抑制烟草的生长。

3.2 低钾对碳代谢的影响

研究表明，低钾环境中，拟南芥根中碳氮代谢酶基因的表达发生了明显的改变，丙酮酸、苹果酸及硝酸盐等的含量也明显下降［27］。供钾恢复正常时，其含量又回归正常。MA等［11］在水稻的研究也得到了类似的结果，有两个PEPCK基因表达显著下调。本研究也发现，低钾条件下，烟草有44个差异表达基因参与了糖及碳水化合物的代谢。它们参与了碳固定、EMP、PPP、蔗糖合成以及淀粉代谢等途径。其中，有5个丙酮酸激酶基因的表达上调。由此可见，低钾胁迫时，烟草通过改变基础碳代谢基因的表达，调整基础代谢，以适应外界的胁迫环境，保证植株的正常生长。

4 结 论

在低钾胁迫下，烟草幼苗众多基因的表达发生了显著的改变。其中，包括了硝酸还原酶基因NIA2等参与无机氮同化的基因，以及UGP等参与碳水化合物代谢的基因。说明烟草在低钾胁迫时，可能通过调节基因的表达，影响到碳氮等基础代谢。本研究的结果为烟草响应低钾胁迫的分子机制研究提供了参考。

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表3 参与碳水化合物及糖代谢相关差异表达基因Table 3 DEGs involved in carbohydrate and sugar metabolism of tobacco seedlings under low potassium stress

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The Impact of Low Potassium Stress on Tobacco Gene Expression Profiles of Carbon and Nitrogen Metabolism

LU Liming， CHEN Yong， LU Yifei， LI Liqin*
（Agronomy College of Sichuan Agriculture University， Chengdu 611130， China）

In order to explore the molecular mechanism of tobacco potassium nutrition， tobacco seedlings of K326 were treated with low potassium stress for 0， 6， 12 and 24 h. Gene expression profiles of tobacco seedlings at each time point were analyzed. The results showed that a total of 3790 genes were detected with a change of two folds or more in expression level （p＜0.05）. GO analysis showed that these differentially expressed genes can be divided into functional classifications including antioxidant activity， stress response，transport activity， development process， catalytic activities， biological regulation， metabolism， etc. Among them， 10 genes， including the nitrate reductase gene NIA2， were involved in nitrogen metabolism， and 44 genes， such as UGP， were involved in the metabolism of carbohydrate and sugar. The results of this study indicate that low potassium stress has a broad impact on gene expression of tobacco，and it may affect the metabolism of carbon and nitrogen in tobacco.

tobacco； low potassium stress； gene expression profiling； gene chips； carbon and nitrogen metabolism

S572.01

1007-5119（2015）04-0012-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.04.002

国家自然科学基金“E3参与植物响应低磷胁迫的分子机制”（31070244）

鲁黎明，男，博士，副教授，研究方向为烟草钾遗传育种。E-mail：luliming@sicau.edu.cn。*通信作者，E-mail：lilq88@126.com

2015-05-05

2015-07-14