基于自体荧光诊断技术的早期肿瘤检测系统的研究

欧辉彬，傅昇

1.海口市人民医院 医学工程处，海南海口 570208；2.海南医学院 海南 海口571199

基于自体荧光诊断技术的早期肿瘤检测系统的研究

欧辉彬1，傅昇2

1.海口市人民医院 医学工程处，海南海口 570208；2.海南医学院 海南 海口571199

癌症防治的关键在于早期发现、早期诊断与早期治疗，最关键在于早期发现[1]。肿瘤早期往往没有明显症状和体征，容易被忽略，而临床上常用的检测手段也还不够理想。因正常组织与癌变组织自体荧光光谱存在明显差异，近年来，激光诱导自体荧光（Laser Induced Auto-Fluorescence，LIAF）光谱技术在诊断恶性肿瘤方面的应用价值已日渐引起国内外肿瘤专家的关注[2-3]。作为一种无创伤内镜下筛选恶性病变的分析方法，该技术具有快速、客观、灵敏度高、无痛无损且简单实用等特点，可检测出常规方法难以发现的早期肿瘤的微弱荧光。本文主要介绍以自体荧光诊断技术为基础的早期肿瘤检测系统的设计过程。

1 设计思路

生物分子在吸收了光能后，从基能态跃迁到高能态；当其再从高能态返回基能态时，就会以光能形式向外释放之前所吸收的外来能量。当采用低功率的激光照射人体组织表面时，组织中的原子或分子吸收光后会被激发到激发态，处于激发态的原子或分子通过能量驰豫过程，返回基能态时会发出光，此光即为自体荧光。

自体荧光的光谱特征与生物组织的光学特性有关。由于人体不同组织的生化组成和形态结构不同，因而不同组织具有独特的光学特性和光谱特征。人体组织有许多能发光的生物分子，如胶原蛋白（荧光峰400 nm）、黄素腺嘌呤二核苷酸（荧光峰520 nm）、弹性蛋白（荧光峰400 nm）、血卟淋衍生物（荧光峰630 nm和680 nm）等[4-6]。正常组织和肿瘤组织由于分化不同，其生化成分也不同；或生化成分相似，但各成分比例不同。因此，正常组织和肿瘤组织在受到同样条件下的激光照射时，所产生的自体光谱形状和强度即波长曲线不同，因而可根椐荧光光谱形状的差异性来区分。

激光诱导荧光内镜就是将激光诱导荧光技术与内镜（胃镜、肠镜）相结合，在内镜检査过程中从内镜活检通道插入光导纤维，利用一定的波长低功率激光照射正常组织与肿瘤组织，诱导产生自体荧光，并由光导纤维收集传输到光谱仪检测，得到荧光光谱，再运用计算机技术对荧光谱进行分析处理，得到可靠的诊断信息。

自体荧光诊断技术与内镜的有机结合为肿瘤的早期诊断提供了一种全新的思路和方法，该方法是一种无侵袭性诊断技术，不损伤正常细胞的生理功能。

早期肿瘤检测系统就是利用激光诱导荧光的方法和激光学原理，对结肠、胃等消化道器官早癌自体荧光检测诊断部分进行设计，为实现肿瘤组织的早期检测与定位提供一种有效的手段。

2 系统主要部件

系统主要由光源（冷光源、激光源）、激光传输及荧光采集光纤、长通滤波器、光谱仪、光电转换器（CCD）、计算机控制系统、显示器、电子内镜（胃镜、肠镜）等组成。系统结构连接图，见图1。

图1 基于自体荧光诊断技术的早期肿瘤检测系统结构连接图

2.1 电子内镜

电子内窥镜的成像原理是利用冷光源所发出的光，经内镜内的导光纤维将光导入受检体腔内；CCD图像传感器接受到体腔内粘膜面反射来的光，将此光转换成电信号，再通过导线将信号输送到电视信息中心；电视信息中心对这些电信号进行贮存和处理，最后传输到电视监视器中，在屏幕上显示出受检腔器的彩色粘膜图像。

其中，电子结肠镜是目前诊断大肠粘膜病变的最佳选择，通过安装于肠镜前端的电子摄像探头将结肠粘膜的图像传至电子计算机处理中心，后显示于监视器屏幕上，可观察到大肠粘膜的微小变化。

在该系统中，电子结肠镜可以通过肠镜的器械通道送入组合光导纤维完成对肠粘膜的激光诱导以及自体荧光的采集和传输，釆集的荧光信号经光谱仪预处理再经计算机进行计算分析得出光谱图形，如发现早癌可用活检钳取相关组织，进行病理切片化验或其他特殊染色，对粘膜病变的性质进行组织学定性，如炎症程度、癌的分化程度等的分级。

2.2 激光源与激光传输及荧光采集光纤

主要包括激发光源和荧光收集部分。激光器所产生的蓝激光束经光纤在内镜的辅助下照射肠粘膜表面，可实现肿瘤组织的实时在体检测。光纤探测端的釆集光纤收集激发出的自体荧光。

2.3 长通滤波器

长通滤波器可在荧光通过时将背景光排除，以提高设备的灵敏度和信噪比。

2.4 光谱仪

光谱仪将复色光分离成光谱的光学仪器，主要由棱镜或衍射光栅等构成，可测量物体表面反射的光线。荧光是可见光，但若通过光谱仪将荧光分解，按波长排列，则可见光只占光谱中很小的范围，其余都是肉眼无法分辨的光谱，如红外线、微波、紫外线、X射线等。

通过光谱仪对光信息进行抓取，再通过CCD将其转换成数字信号的工作原理为：当一朿复合光线进入光谱仪的入射狭缝时，首先经光学准直镜准直成平行光，再经衍射光栅色散为分开的波长，使光信号在空间上分散成为多条光束；然后利用不同波长离开光栅的角度不同，因此每一像点对应于某一特定波长的原理，由聚焦反射镜成像于出射狭缝。

2.5 光电转换器

CCD主要利用光电效应将光信号转换成电信号，CCD芯片上有许多单元，可以将不同的光线转成不同的电荷，从而对应自体荧光的电荷图像。

3 激光诱导自体荧光的采集处理过程

以诊断大肠粘膜病变为例，该系统激光诱导字体荧光的采集处理过程如下：激光器发出蓝色激光束，通过透镜经组合光纤探测端照射至肠粘膜面；光纤探头在垂直方向轻轻触及粘膜表面进行测定，收集400～700 nm范围的荧光光谱；荧光经采集光纤进入光谱仪，CCD光电信号转换为数字信号传输至计算机，经专用分析软件进分析处理，转换为与自体荧光相对应的光谱曲线图，为医生临床诊断提供准确参考依据。

4 系统试验及分析

在研究阶段，先测量一些正常组织的荧光，比较人体同一组织不同部位和不同人体同部位、同组织的荧光差异，以及激发波长和功率变化对研究带来的影响。由收集光纤通过光谱仪将荧光转化为电信号输入到计箅机以获取数据，再经wispec软件进行处理，绘制光谱图像并保存为*.spe文件（*.spe文件把光谱图像所有点的横纵坐标以特硃的文件格式存储，以便计算机读取数椐）。

在系安装调试后，测量了不同病人大肠组织的自体荧光光谱，所用光谱仪的分辩率为0.3～10.0 nm。试验中，对大肠组织进行自体荧光测量并结合病理检査进行验证，共制作了1100幅自体荧光光谱图，本文从中筛选出两幅比较典型的正常组织与癌变组织的对照图（图2）。

图2 正常组织与癌变组织的自体荧光光谱图 多

图2中，上图为正常大肠组织的LIAF光谱图，图中3条曲线为同组织中不同部位所测出的自体荧光光谱图，曲线均为单峰但强度不同；下图为大肠癌变组织LIAF光谱图，3条曲线圴显示双峰，与正常组织相比，强度明显减弱。肿瘤组织在500 nm处有一主峰，在630 nm和680 nm有两处个次峰，而正常组织在490 nm处有一主峰，没有次峰出现，正常组织的荧光强度要大于癌组织。

以图2中相关数据为基础经归一化处理得到的标准化强度与波长之间的关系趋势图（波长范围500～700 nm），见图3。正常大肠组织光谱图中，3条曲线均自波长在500 nm（强度1.0）之后荧光强度逐渐降低，700 nm处为最低点，3条曲线分别在500 nm和700 nm处重合。大肠癌变组织光谱图中，由一曲线从560 nm处开始，强度逐渐增强，在630 nm（强度0.75）处达到最高峰；另一曲线则从660 nm处开始，强度逐渐增强，自680 nm（强度0.45）处后下降；3条曲线在700 nm处重合。

图3 标准化强度与波长之间的关系趋势图

上述分析表明，该系统能够较好地检测出正常组织与癌变组织的自体荧光光谱，且二者光谱具有较明显的差异性，表现在光谱形状、荧光强度、光谱峰值强度、不同峰值间的比值、峰值变化率等方面，其中主要的改变是荧光强度。但如何有效去除检测过程中人为或仪器的干扰，寻求既能降低图像噪声又能保持图像清晰度的去噪方法尚需探讨。

5 自体荧光诊断技木与其他诊断方法的比较

目前常用的早期肿癌诊断技术有3种：碘染色、美蓝染色、电子染色[7-9]。

（1）碘染色：是指使用碘溶液进行内镜下人体内部部位的染色，正常区域则涂复方碘，呈深棕色。检査主要观察不着色区域的分布，异常图像部位或可疑病変部位须取点送病理检查。

（2）美蓝染色：是指在内镜直视下喷洒美蓝染色目标区域，经病理检查得出结果。

上述两种方法虽然有助于病变组织良恶性的判断，可显示不易发现的病灶，但也有其不足之处：① 不能全程喷洒；② 碘有强刺激性作用，可引发烧心、过敏性哮喘等症状；③ 碘染特异性低；④ 靛胭脂可引起血压升高、心动过速。

（3）电子染色：是指利用窄带滤光器过滤掉内镜白光所发出的红蓝绿光波中的红光，仅留下中心波长分别为540和415 nm的绿光和蓝光。由于窄波光没有覆盖所有可见光光谱，到达黏膜的深度不同，通过绿、蓝顺次成像可得到不同层次的形态图像，用于诊断消化道的各种疾病。其优点是视角淸晰、操作简单、高效无痛安全性高、准确率较高；但也有明显不足之处：① 食管清洁度对诊断结果有影响；② 粘膜表面出血影响观察效果；③ 早癌诊断的准确率依赖于操作者的经验[10]。

与上述几种方法对比，自体荧光技术诊断消化道早癌优势凸显：① 全程普查，而且对同一部位可进行多次“光活检”，无染色剂所带来的副作用及风险；② 可于活体内实时作出快速诊断，灵敏度和准确度高，能发现在内镜直视下难以发现的病灶；③ 活检时，能指示正确的取材部位；④ 无创伤。

随着自体荧光诊断技术的发展和成熟，以自体荧光诊断技术为基础的早期肿瘤检测系统会逐步体现其优势，为早癌发现提供一种新的诊断手段。

[1] 吴君,黄多,贺超,等．结合乳腺影像报告及数据系统的超声乳腺肿瘤辅助诊断系统的研究现状[J]．中国医疗设备,2013,28(3):77-79．

[2] 王渊璟,张阳德,任力峰．激光诱导自体荧光技术与大肠癌的早期诊断[J]．中国激光医学杂志,2000,9(4):249-251．

[3] 徐国祥．实用激光医学[M]．广州:广东高教出版社,1990:220-223．

[4] 李为光．消化内镜自发荧光技术[J]．胃肠病学,2007,12(7):435-438．

[5] 罗湘建,张阳德,李建国,等．激光诱寻大肠癌自体荧光光谱实验研究[J]．生物医学工程学杂志,2005,22(6):1231-1233．

[6] 张阳德,唐贵林,刘蔚东,等．大肠正常组织和癌组织的显微自体荧光差异研究[J]．中国激光医学杂志,2001,10(4):205-208．

[7] 谢洪波,邓红梅,郁道银,等．结肠肿瘤组织自体荧光光谱体内测试[J]．应用激光,2000,20(1):43-46．

[8] 陈国珍,黄智贤,郑朱梓,等．荧光分析法[M]．2版．北京:科学出版社,1990．

[9] 李民赞．光谱分析技术其应用[M]． 北京:科学出版社,2006: 145-150．

[10] Fu S,Chia TC,Kwek LC,et al．High sensitivity and specificity of laser-induced autofluorescence spectra for detection of colorectal cancer with an artificial neural network[J]．Applied Optics,2005,44(19):4004-4008．

Research on the Laser Induced Auto Fluorescence Based Early-Stage Tumor Diagnosis System

OU Hui-bin1, FU Sheng2
1.Department of Biomedical Engineering, People's Hospital of Haikou, Haikou Hainan 570208, China; 2. Hainan Medical University, Haikou Hainan 571199, China

激光诱导的自体荧光诊断技术具有灵敏度高、无痛无创、能发现早期肿瘤的微弱荧光并确定肿瘤边界等优点。本文详细介绍了以自体荧光诊断技术为基础的早期肿瘤检测系统的设计思路、结构组成、工作原理及实际试验内容，并对自体荧光诊断技术与常规早期肿瘤诊断手段如电子染色、碘染色、美蓝染色等进行了比较。

激光诱导；自体荧光诊断技术；早期肿瘤检测；电子内窥镜

The LIAF (Laser-Induced Auto-Fluorescence) diagnostic technique was featured with high sensitivity, painlessness, non-invasion and the capability of identifying the slight fluorescence of early tumors and the cancerous boundary. This paper detailed the design, structure, working principle and actual experiment content of the LIAF-based early-stage tumor diagnosis system. Moreover, comparisons were made between the auto-fluorescence diagnostic technique and conventional early-stage tumor diagnostic techniques in the aspects of electron staining, iodine staining and methylene blue staining.

laser induction; auto-fluorescence; early-stage tumor diagnosis; electronic endoscope

R730.4

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2015.04.008

1674-1633(2015)04-0028-04

2014-07-18

作者邮箱：lishuyuanyuan@163．com