微小RNA在急性心肌梗死中调控作用的研究进展*

彭兰芬，陈载鑫，张少丰，辛培建 综述，朱振宇△> 审校

(1.广东医学院附属厚街医院检验医学中心，广东东莞 523945；2.中山大学临床检验标准化研究中心，广州 510080)



·综 述·

微小RNA在急性心肌梗死中调控作用的研究进展*

彭兰芬1，陈载鑫1，张少丰1，辛培建2综述，朱振宇2△> 审校

(1.广东医学院附属厚街医院检验医学中心，广东东莞 523945；2.中山大学临床检验标准化研究中心，广州 510080)

微小RNA； 急性心肌梗死； 生物标志物

急性心肌梗死(AMI)是冠心病的一种危重临床类型，其进展迅速，后果严重。如果在数小时内得不到明确诊断及适当的治疗，心肌就会缺血缺氧造成不可逆的坏死，因此，AMI的早期诊断至关重要。

微小RNA(miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的小分子单链RNA，广泛存在于真核生物中。它由DNA转录产生，但并不翻译成蛋白质，而是在蛋白质合成中调节其他基因功能，因此miRNA是调控其他蛋白质编码基因的基因[1]。miRNA在生物的生长、发育和疾病发生的病理生理机制中扮演着重要角色，许多疾病以一种或几种miRNA表达异常为特征。确定组织或者血浆中表达量异常的miRNA种类，对于疾病的早期诊断和发展进程都有重要作用[2]。循环外周血液中心肌细胞来源的miRNAs在心血管系统疾病发生的生理和病理机制中都发挥非常重要的作用，其表达远远早于各种释放到循环血液中的蛋白质如各种心肌生化标志物的出现，是心血管疾病新的标志物，多种心血管系统疾病的病理改变早期有miRNA分子的参与，包括AMI、心肌病、心律失常和动脉血管硬化等[3]。尽管miRNA 的功能尚待阐明，但通过对其表达谱的研究已经发现miRNA具有很强的细胞、组织或疾病特异性，这些特异表达的miRNA既是其功能研究的基础，又是很好的疾病标志物[4]。

1 miRNA生物合成及功能

miRNA的合成从转录生成初级miRNA(pri-miRNA)开始，通过Drosha和Dicer等相关合成酶的加工，最终生成成熟的miRNA，成熟的miRNA和相关蛋白质形成RNA诱导沉默复合物(RISC，也称miRISC)调控基因转录后的翻译过程[5]。

成熟miRNA调控靶mRNA翻译的机制主要有三种：(1)二者不完全互补，即二者不完全配对结合时，主要影响翻译过程，而对mRNA的稳定性无任何影响。(2)二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。(3)上述两种模式均具备，当其与靶mRNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。

上述miRNA调控mRNA表达的机制说明miRNA与靶mRNA不是一一对应的关系，一个miRNA可以调控不同的mRNA的表达，而多个miRNA可以调控同一个mRNA的表达。鉴于miRNA在生物体担负着举足轻重的作用，越来越多的实验室开展了miRNA的相关研究。现在，对miRNA生物机制的研究和miRNA与疾病关系的研究已成为世界生物学的研究热点之一。

2 miRNA在AMI中的调控作用

2.1 miRNA与动脉粥样硬化病理进程相关 AMI最根本的原因是冠状动脉粥样硬化和在此基础上形成冠状动脉血栓所致。miRNA可以通过对内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞和单核细胞等相关细胞功能和形态的调控，通过影响脂质代谢途径、慢性炎性反应过程及对血小板的活化和聚集，参与冠状动脉粥样硬化的发病过程。最近Loyer等[6]在小鼠中的研究发现，动脉粥样硬化进程与血管内血流切变力和氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxLDL)密切相关，提出miRNA-92a为动脉粥样硬化相关miRNA，称其为atheromiR。通过对小鼠动脉和人动脉粥样硬化斑块分析显示，miRNA-92a作为动脉粥样硬化的候选miRNA，在低切变力和oxLDL的共同作用下，可调节内皮细胞的活化并优先表达于低切变力处。miRNA-92a的这种表达方式与Kruppel样转录因子(KLF)2、KLF4和细胞信号传导抑制因子5相关，所以通过抑制其表达可防止内皮细胞功能紊乱和动脉粥样硬化的发生。另有研究发现,miRNA-126参与调控内皮细胞的迁移、增殖及凋亡，敲除老鼠 miRNA-126的基因序列后，造成血管完整性的破坏及影响血管的形成；miRNA-21通过增加黏附分子作用于过氧化物酶增殖物激活受体α(PPAR-α),使PPAR-a表达减少，促进动脉粥样硬化进展；miRNA-146a与动脉粥样斑块形成的病理过程及斑块的稳定性相关[7-9]。

2.2 miRNA与心脏基因调控有关 miRNA的表达具有细胞和组织特异性，目前认为具肌肉和心脏组织特异性且在心肌细胞中表达丰富miRNA有五种，分别为miR-1、miR-133、miR-206、miR-208、miR-499。其中miR-1和miR-133具肌肉特异性并调节心脏的生长发育；miR-208和miR-499则具有心脏组织特异性并且在心肌中表达丰富。以上miRNA在AMI等心脏疾病的发病机制、诊断、预后和治疗方面均具有重大意义[10]。现已有研究提示miR-1、miR-18b、miR-21、miR-133、miR-195、miR-208等参与控制或调节心肌肥大这一病理过程。miR-1、miR-133a、miR-208在AMI鼠动物模型或冠脉闭塞-局部缺血再灌注猪动物模型中均显著升高，并在120 min内呈现高峰。而在经皮冠脉介入治疗的STEMI患者循环血浆中均显著升高，其中miR-208最初检测不到，在症状出现后约1 h随即升高，在12 h内呈现峰值。同时认为miR-1和miR-133与肾小球过滤率有负相关，表明其可能在一定时间段后被肾清除，并在尿液中检测到，但未检测到miR-208。miR-208与肌钙蛋白T和射血分数相关[11-12]。

2009年美国新泽西州学者Dong等[13]在AMI大鼠模型中研究了miR-21的表达情况，认为miR-21在梗死区明显下调，而在梗死区周边却上调；梗死区的过表达可明显减少梗死面积；2011德国学者关于AMI患者外周血液中的全基因组miR表达分析的相关研究表明，miR-1291、miR-663b具有诊断AMI的高敏感度和特异度，采用20个miRNA谱，其诊断效能更佳(敏感度90%、特异度96%、准确度93%)，而miR-30c、miR-145表达水平与梗死范围大小及心肌钙蛋白T(cTnT)释放相关，认为miR是潜在治疗靶标[14]。

国内学者对心肌梗死相关性miRNA研究情况：2010年哈尔滨医科大学研究人员对循环血液中的miR-1进行了研究，认为其可作为潜在的AMI标志物[15]；山东徐冬梅等[16]研究认为 miR-1与心肌缺血损伤有关；韦永强等[17]为观察AMI患者miR-1表达情况和体外反搏治疗(ECP)对其水平的影响，结果显示miR-1可作为AMI患者发病和病情进展的一项新型标志物。ECP可使miR-1表达下调，患者心功能获得改善。

2.3 参与心肌纤维化 心肌纤维化是由中度至重度的冠状动脉粥样硬化性狭窄引起心肌纤维持续性和(或)反复加重的心肌缺血缺氧所产生的结果，是心脏重塑的另一重要病理改变。miR-29家族(miR-29a、miR-29b、miR-29c)与心肌纤维化相关[18]，能够抑制心肌纤维化的发生。在心脏中miR-29主要表达于心肌成纤维细胞，许多细胞外基质相关的基因(如ELN、FBN1、COL1A1、COL1A2、COL3A1)是miR-29的靶基因。研究发现，发生心肌梗死后第3天miR-29下调与I型、III型胶原蛋白相关基因(COL1A1、COL1A2、COL3A1)表达上调有关，且在梗死边缘区出现弹性蛋白表达增加[10]。miR 133 和miR 30c也与心肌纤维化有关。北京施冰等[19]研究了大鼠AMI模型miR-214的表达变化，认为miR-214可能参与调控了心肌梗死后心室重塑。

2.4 参与血管新成的miRNA miR-130a、miR-17～92簇和miR-378是促进血管生成的miRNA，而miR-221、miR-222则通过作用于其靶基因干细胞因子受体c-kit并间接调节内皮细胞一氧化氮酶(eNOs)的表达，进而抑制血管内皮细胞分化、增殖、血管生成，而miR-15b通过可能的靶基因血管内皮生长因子和血管生成素2(Ang2)来抑制新血管和生成[10]。miR-320的许多靶基因均与血管生成相关。miRNA-126在新血管形成中发挥了重要作用，血管内皮miRNA-126是缺血相关血管生成信号的重要潜在靶点和调节位点[9，20]。

2.5 miRNA与心肌细胞电生理调控 心脏的电生理活动由离子通道和膜蛋白控制，miRNA调节心脏传导和心律失常。AMI后心律失常的发生率几乎为100%，室性心律失常是心脏猝死的高风险因素，而心力衰竭则是心血管疾病病变的终末期。心衰患者发生房颤最为常见，是患者死亡的主要原因。目前关于探讨离子通道等相关基因与miRNA的关系成为研究热点[21]。研究较多的是miRNA-1、miRNA-328、miRNA-26和miRNA-499。miRNA-1具心肌特异性，在房颤患者组织样品中表达减少86%，其作用靶点是心脏内向整流钾通道电流和间隙连接蛋白基因；有趣的是，其在室性心律失常下表达水平却增加。因此在心房与心室不同组织中其调控作用有待进一步深入研究；miRNA-26也可有效地抑制内向整流钾通道电流减少心律失常的发生[22-23]。房颤患者中miRNA-328表达增强，其作用靶点是编码L-型钙通道的CACNA1C和CACNB1，此外miRNA-328水平的升高可减少钾内流和缩短动作电位间期APD，导致心律失常发生的可能。另外，AF患者心房组织中miRNA-499上调，有利于AF电生理重构，其靶基因是编码SK3(人类弱传导钙激活钾通道蛋白hsKCa3)的KCNN3(Ca2+激活K+通道蛋白基因3)[24-25]。

3 miRNA的临床应用

3.1 miRNA稳定性与检测方法 由于难于获取心脏组织，miRNA的检测主要依赖于外周血液标本。miRNA在血浆、血清和尿液中的稳定性非常好。Mitchell等[26]和Tijsen等[27]发现血浆室温放置24 h或反复冻融8次，或极端pH(pH=1和pH=13)处理3 h和DNA酶(DNase)处理3 h，对血浆中内源miRNA分子几乎没有影响。而其他大多数RNAs在这些条件下一般都会被降解。另外，Chen等[4]采用RT-PCR方法从肺癌A549细胞提取的RNA中随机扩增出一些miRNA，RNase处理3 h后，仍可以检测到半数以上的miRNA，而对照的大分子RNA(18S rRNA、28S rRNA、GAPDH、β-actin、U6)则被迅速降解，显示了血浆、血清等体液中的miRNA 作为理想的疾病标志物所需的某些特征。血浆中RNA耐受RNase降解的可能机制：(1)RNA可能与DNA退火，使得它们既耐受DNase降解又能耐受RNase降解；(2)RNA可能被包入脂质或脂蛋白复合物内而受到保护；(3)RNA可能是通过化学修饰或者和蛋白结合而受到保护。

循环miRNA检测通常包括：miRNA的提取,可用Trizol LS或离心柱法分离纯化；反转录；荧光定量PCR。目前miRNA检测的qRT-PCR方法主要是基于茎-环的RT-PCR方法和基于poly(A)加尾的RT-PCR方法。这两种方法均可以采用Taqman探针或者SYBR荧光染料，前者特异性更高，后者通用性好。

3.2 miRNA临床诊断 miRNA的表达具有组织特异性，临床可通过测定miRNA水平来早期诊断或鉴别诊断疾病。血浆中miRNA水平对心脏疾病的诊断已多有报道[10-15]。Corsten等[28]分别在AMI、病毒性心肌炎、扩张型心肌病和急性心力衰竭患者中进行了心脏相关miR(miR1、miR133a、miR208b、miR499)，纤维化相关miR(miR21、miR29b)和炎性相关miR(miR146、miR155、miR223)的研究，发现相对于健康对照组来说，AMI患者miR208b和miR499分别呈1 600倍和100倍升高，并与肌钙蛋白T(cTnT)相关，说明其从受损心肌细胞释放；在病毒性心肌炎中二者分别呈30倍和6倍升高；在心衰患者中则呈现2倍左右升高；在扩张性心肌病中未发现变化。同时炎症相关miRNA并未发现明显升高。

Tijsen等[27]证实了血浆miRNA-423-5p的水平可作为心力衰竭的又一项诊断指标，血浆中的miRNA可评估心脏疾病的严重程度和预后。比如，血浆miRNA-30c和血浆miRNA-145与cTnT水平显著相关，可用来反映梗死面积，继而判断心肌梗死严重程度和预后[29-30]。

3.3 miRNA临床治疗 miRNA在心血管疾病的病理生理学的作用普遍存在，不论是上调或下调可作为介入治疗的靶点。目前在治疗上的方法主要有两大类：一是增强miRNA表达方面的功能获得性研究，如设计合适的病毒载体，最为有用的是腺相关病毒(AAVs)，其方法是通过导入感兴趣的miRNA片段到载体中，AAVs特定的血清型与心肌细胞高度亲和并具低免疫原性，使得它们适于将核酸传递给心肌细胞达治疗目的。二是miRNA功能抑制性方法研究，利用miRNA反义寡核苷酸如2-O-甲基修饰的寡核苷酸，通常将其命名为miRNA拮抗剂antagmomir，结构上与miRNA互补结合抑制其功能。同样作用的还有锁核苷酸(LNA)和miRNA“海绵”。虽然从理论上来说，上述方法可直接调整miRNA水平进而影响其功能，但miRNA与靶mRNA不是一一对应的关系，一个miRNA可以调控不同的mRNA的表达，而多个miRNA可以调控同一个mRNA的表达。如上调miRNA-133可改善心肌肥大，但另一方面却容易导致心律失常。如何使miRNA治疗方法最优化服务临床，还任重道远[31]。

4 小 结

miRNA是近5年来生命科学和医学界的明星分子，其作为新的疾病诊断标志物，非常值得关注与期待。许多疾病以一种或多种miRNA表达异常为特征，确定组织或者血浆中表达量异常的miRNA种类，对于疾病的早期诊断和鉴别诊断都有重要作用。近年来对 miRNA 的研究已取得重大进展，越来越多的 miRNA被陆续发现，生物学功能也逐渐得到阐明，但是 miRNA在心血管疾病中的功能及其作用机制仍有待探讨，在疾病进程中循环miRNA谱发生改变的机制目前仍不十分明确，因此探求在特定组织或细胞中富集表达的miRNA，对于寻求组织损伤性疾病的血清miRNA标志物，探讨miRNA在心血管疾病中的调节作用及其机制及基因治疗方面具有积极意义。

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广东省东莞市科技局重点课题资助项目(2012105102030)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.19.063

A

1672-9455(2015)19-2959-04

2015-02-02

2015-05-05)

△通讯作者，E-mail：zhuzheny@mail.sysu.edu.cn。