乙型肝炎病毒对白细胞介素35表达影响的研究

祝成亮，李 艳，袁 丽，刘兴晖

(1.武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060；2.上海市浦东新区公利医院检验科，上海 200135)

乙型肝炎病毒对白细胞介素35表达影响的研究

祝成亮1，李 艳1，袁 丽1，刘兴晖2

(1.武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060；2.上海市浦东新区公利医院检验科，上海 200135)

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对白细胞介素35(IL-35)表达的影响。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测108例乙型肝炎患者和115例健康对照者IL-35的血清含量，将HBV感染性克隆pHBV1.3转染THP-1细胞，采用逆转录PCR(RT-PCR)及ELISA检测细胞IL-35 mRNA及蛋白的表达。结果HBV患者IL-35血清水平明显高于健康对照者，差异有统计学意义(P＜0.05)，THP-1细胞转染pHBV1.3后IL-35mRNA及蛋白的表达升高。结论HBV能够上调IL-35的表达。

乙型肝炎病毒；白细胞介素35；酶联免疫吸附试验；表达

乙型肝炎病毒(HBV)是导致乙型肝炎和原发性肝细胞癌的病原体。研究表明，HBV感染后引起机体的免疫应答反应，促进很多炎症因子的过度表达和分泌，导致肝细胞的破坏和肝脏组织的损伤[1]。白细胞介素35(IL-35)属于IL-12家族的新成员，包括病毒诱导基因3(EBI3)和IL-12 p35两个亚基，是一种抑制性细胞因子，由调节性T细胞合成和分泌[2]。但目前尚未有HBV与IL-35相关性的研究报道。本研究主要通过体内外实验探讨HBV对IL-35表达的影响，为揭示HBV的致病机理奠定一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院临床确诊的乙型肝炎患者108例，其中，男65例，女43例，平均(35.9±15.3)岁。选择115例健康体检者作为正常对照组，其中男性62例，女性53例，平均(37.8±16.8)岁。所有患者均无其他嗜肝病毒的感染。

1.2 材料 单核细胞株THP-1由武汉大学典型培养物保藏中心提供RNA提取试剂TRIzolR购自invitrogen公司；IL-35 ELISA检测试剂盒购自Cusabio Biotech公司；M-MLV逆转录酶购自Promega公司；HBV感染性克隆pHBV1.3由本室保存；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 THP-1细胞的培养 THP-1培养在RPMI1640培养液(含10%的胎牛血清，100 mg/L链霉素和100 U/ml青霉素)，在37℃、浓度为5%CO2恒温箱中进行培养。

1.3.2 THP-1细胞转染 采用电穿孔进行转染，待THP-1细胞至对数生长晚期，4℃离心收集细胞，洗涤后加入电穿孔缓冲液重悬，加入质粒DNA混匀，设置电压为300 V，电流1 000µF进行电穿孔。

1.3.3 RT-PCR检测 TRIzolR提取THP-1细胞的RNA，M-MLV逆转录酶反转录成cDNA，用IL-35两个亚基基因的检测引物p35：5'-CTCCTTGTGGCTACCCTG-3'(上游引物)，5'-GCAACTCCCATTAGTTATGAA-3'(下游引物)，EBI3：5'-CCGCCTGCTCCAAACTCCAC-3'(上游引物)，5'-CGGGCTTGATGATGTGCTCTGT-3'(下游引物)进行PCR扩增，同时用β-actin的检测引物进行平行PCR扩增[3]，产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.4 ELISA检测 IL-35检测采用ELISA检测试剂盒，按照说明书操作进行测定。

1.4 统计学方法 统计学分析采用SPSS13.0软件，数据以均数±标准差(±s)表示，健康对照和HBV患者IL-35血清含量的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV患者IL-35血清水平升高 笔者采用ELISA分别检测了HBV患者和健康体检者的IL-35血清含量。结果显示，HBV患者血清IL-35水平为(387.3±126.5)pg/ml，健康对照为(158.7±48.4)pg/ml，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 HBV在细胞水平上调IL-35 mRNA和蛋白的表达 为探讨HBV在细胞水平对IL-35表达的影响，笔者将HBV感染性克隆pHBV1.3转染THP-1细胞，同时设立转染空载体pBlue-ks作为空白对照。48 h后，笔者检测了IL-35 mRNA和蛋白的表达情况，结果表明，转染pHBV1.3后IL-35 mRNA表达上调，同时细胞上清中IL-35的含量较空白对照高[(216.3±25.1)pg/ml vs(136.5±18.7)pg/ml]，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 IL-35两个亚基p35和EBI3 mRNA的检测

3 讨论

HBV感染是一个全球性问题，大约20亿人感染乙肝病毒，其中有3.5亿人为慢性感染。HBV感染会导致急性或慢性肝损伤，甚至肝硬化、肝细胞癌[4]，但HBV的致病及致癌机理目前尚不清楚。研究表明，HBV感染机体会引起一些细胞因子表达水平的改变，如IL-6、IL-12在HBV感染后血清水平升高[5]。我们前期的研究工作也发现HBV患者IL-27的表达水平升高，本研究通过体内试验探讨了HBV对IL-35表达的影响。检测结果显示，HBV患者IL-35血清含量高于正常对照，表明HBV能够在体内上调IL-35的表达，进一步通过细胞水平进行了证实，pHBV1.3是HBV的感染性克隆，将pHBV1.3转染单核细胞株THP-1建立HBV细胞感染的模型[3]，结果表明，转染pHBV1.3后，IL-35 mRNA和蛋白的含量均升高，证实HBV能够在体外上调IL-35的表达。

IL-35是IL-12家族的新成员，主要有调节性T细胞(Treg)调节性B细胞(Breg)合成和分泌，具有重要的生物学功能，如刺激Treg细胞增殖、抑制Teff增殖、抑制Th17细胞的分化等，同时在机体抗感染，自身免疫性疾病的发生和发展等方面均发挥着重要作用[5]。

目前认为，HBV致病并非HBV直接损伤肝细胞，而是由于病毒感染人体后所引发的机体免疫应答导致肝脏的病理性损伤所致。HBV感染后引起体内细胞因子如IL-27、IL-35等的过量表达，这些细胞因子参与机体的炎症反应，过度的炎症反应引起肝脏不断地被修复和损伤，逐渐发展为肝纤维化，最终会导致肝癌的发生。

综上所述，本研究证实了HBV能够在体内外上调IL-35的表达，但HBV如何调节IL-35的表达，其分子机制如何？IL-35对HBV的复制有无影响，尚待进一步研究。

[1]Busca A,Kumar A.Innate immune responses in hepatitis B virus (HBV)infection[J].Virol J,2014,11:22.

[2]Yang Y,Xuan M,Zhang X,et al.Decreased IL-35 levels in patients with immune thrombocytopenia[J].Hum Immunol,2014,75(8): 909-913.

[3]Zhu CL,Zhang R,Liu L,et al.Hepatitis B virus enhances interleukin-27 expression bothin vivoandin vitro[J].Clin Immunol,2009, 131(1):92-97.

[4]You CR,Lee SW,Jang JW,et al.Update on hepatitis B virus infection[J].World J Gastroenterol,2014,20(37):13293-13305.

[5]Wang S,Chen Z,Hu C,et al.Hepatitis B virus surface antigen selectively inhibits TLR2 ligand-induced IL-12 production in monocytes/ macrophages by interfering with JNK activation[J].J Immunol, 2013,190(10):5142-5151.

Effect of hepatitis B virus on the expression of interleukin 35.

ZHU Cheng-liang1,LI Yan1,YUAN Li1,LIU Xing-hui2.1.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA; 2.Department of Clinical Laboratory,Shanghai Pudong New District Gongli Hospital,Shanghai 200135,CHINA

ObjectiveTo oexplore the effect of hepatitis B virus(HBV)on the expression of interleukin 35 (IL-35).MethodsSerum levels of IL-35 in 108 patients of HBV and 115 healthy controls were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).HBV infectious clone pHBV1.3 was transfected into HepG2 cells. RT-PCR and ELISA were used to measure the expression of mRNA and protein.ResultsSerum level of IL-35 was significantly higher in HBV patients as compared with healthy controls(P＜0.05).Expression of IL-35 mRNA and protein were elevated with pHBV1.3 transfected.ConclusionHBV can upregulate the expression of IL-35.

Hepatitis B virus;Interleukin 35;Enzyme-linked immunosorbent assay;Expression

R512.6+2

A

1003—6350（2015）19—2874—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1045

2015-04-14)

国家自然科学基金(编号：81101485)；国家临床重点专科专项经费(编号：2010305)；湖北省自然科学基金(编号：ZRY2014000315)

李 艳。E-mail：48329061@qq.com