甘草提取物对人表皮黑素细胞迁移及细胞内钙离子的影响

黎 雯，牛 牧，黄瑞叶

(海南省皮肤病医院皮肤外科，海南 海口 570206)

甘草提取物对人表皮黑素细胞迁移及细胞内钙离子的影响

黎 雯，牛 牧，黄瑞叶

(海南省皮肤病医院皮肤外科，海南 海口 570206)

目的 探讨甘草提取物对体外培养人表皮黑素细胞迁移和细胞内游离钙离子浓度的影响。方法从健康人包皮组织分离、培养黑素细胞，用甘草提取物处理黑素细胞，对照组仅加入等量培养基，采用Transwell微孔膜法研究黑素细胞迁移，采用激光共聚焦扫描显微镜检测钙离子。结果当甘草提取物在浓度＞1.25 mg/L时，其黑素细胞迁移数目与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；实验浓度下的甘草提取物经处理后均能降低人黑素细胞内钙离子的水平；不同浓度甘草提取物对黑素细胞细胞内钙离子的影响与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05）。结论推测甘草提取物可能通过降低黑素细胞内游离钙离子的浓度从而抑制进黑素细胞的迁移。

黑素细胞；甘草提取物；迁移；钙离子

甘草是中医治疗中较为常用的药物，祖国医学认为甘草具有补脾益气、祛痰止咳、清热解毒、缓急止痛、调和诸药的功效。西方医学研究发现甘草具有抗炎、抗氧化、抗变态反应和美白的作用[1]。甘草的化学成分较为复杂，现在已从甘草中分离出的较多化合物，但其中主要成分为甘草甜素、甘草次酸。近年来有研究提示甘草有抑制黑素细胞酪氨酸酶和黑素瘤细胞黑素合成的作用[2]。为深入研究甘草对人表皮黑素细胞的调控作用，笔者首先体外分离、培养正常人表皮黑素细胞，然后采用不同浓度的甘草提取物处理黑素细胞，观察黑素细胞增殖情况，通过检测细胞内钙离子浓度的变化，以探讨甘草提取物对其可能的作用机制，为化妆品及药物的研发提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药品 甘草提取物采购自中国药品生物制品所。先用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度100 g/L母液，置于-20℃冰箱低温保存，实验过程中用新鲜培养基调至终浓度。

1.2 主要试剂的配制 M254培养基、人黑素细胞生长添加剂HMGS购自美国Cascade公司；MTS购自美国Promega公司；青霉素-链霉素双抗、0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；DMSO购于美国Sigma公司；Dispase分离酶购自美国罗氏试剂公司；

1.3 细胞来源 健康人表皮黑素细胞，来源于6～18岁青少年男性包皮环切术后的包皮组织，由海南省皮肤病医院皮肤外科门诊手术室提供。患者已知情同意。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 分别设定甘草提取物浓度为1.25 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L，对照组仅加入等量培养基，其甘草提取物浓度为0。

1.4.2 分离人表皮黑素细胞 首先将包皮组织放在75%的酒精中浸泡约10 min，拿出后用磷酸盐缓冲液(PBS)液冲洗5～8次；使用眼科剪剔除脂肪组织，再用PBS液冲洗5～6次；将组织剪为1.5 mm×1.5 mm的组织块，置于培养皿中；加入Dispase酶5 ml，置于4℃冰箱中16 h，后移入培养箱孵育1 h；然后剪去真皮，留下表皮。再使用PBS冲洗组织2～3次，常温下0.25%胰蛋白酶消化5 min，最后加入FBS终止。玻璃管吹打组织，制成人表皮黑素细胞悬液，后用200目细胞筛过滤，低速离心(1 200 r/min)3 min后细胞计数。调整细胞浓度为5×104/ml，接种于无菌培养瓶中，每瓶加入M254完全培养基4 ml，随后置于37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养。48 h后可给予首次换液，以后每隔2～3 d换液1次，方法同文献[3]。

1.4.3 人表皮黑素细胞的鉴定(L-DOPA染色法) 取第三代人表皮黑素细胞，消化后调整黑素细胞浓度至1×104/ml，接种在6孔培养板中，置于培养箱中培养48 h。后加入已预热至37℃的4%多聚甲醛固定细胞25 min，双蒸水冲洗3次。将细胞盖玻片转移至L-DOPA染色液中浸泡，每隔30 min观察染色情况，约3 h后染液呈棕色，漂洗盖玻片，复染细胞核，梯度酒精逐级脱水，最后二甲苯透明及中性树胶封片。

1.4.4 不同浓度甘草提取物对人表皮黑素细胞迁移的影响 选取孔洞直径为8.0 μm的聚碳酸酯膜Transwell小室。把纤连蛋白(FN)用培养基稀释至20 μg/ml，室温下Transwell小室底面包被。黑素细胞消化后重悬于含0.1%FBS的M254培养基中，调整细胞浓度至1×105/ml。然后在每个Transwell上室加入100 μl；下室内分别加入浓度为1.25 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L的甘草提取物完全培养液500 μl，另设对照组，仅添加完全培养基。每孔均设3个复孔，置于培养箱中培养24 h。随后取出Transwell小室，用棉签拭去上层小室的细胞，甲醛将下室面的黑色细胞固定25 min，将聚碳酸酯膜用刀片切下，用苏木精染色10 min，每张膜在高倍镜下随机选取3个视野，观察并计算移行的黑素细胞数量。实验重复3次，方法参考文献[4]。

1.4.5 人表皮黑素细胞内钙离子测定 消化细胞后，调整细胞浓度至1×104/ml，接种于中央打孔的培养皿中，加入培养基500 μl，另设对照组，仅添加完全培养基。培养24 h后，分别给予1.25 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L甘草提取物完全培养基培养24 h，后用PBS冲洗，于37℃用10 μmol/L Fluo-3/AM负载30 min，PBS冲洗，置于激光共聚焦显微镜载物台，Bio-Rad激光共聚焦软件，动态扫描细胞内荧光强度改变(激发波长488 nm，发射波长526 nm)，实验重复3次。

1.5 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，计量资料的比较采用t检验，计数资料的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人表皮黑素细胞鉴定结果 经左旋多巴染色后，镜下可见人表皮黑素细胞树突及胞浆呈黑色或棕褐色，此为阳性反应，证明为黑素细胞，见图1。

图1 L-DOPA染色阳性人表皮黑素细胞(×200）

2.2 甘草提取物对人表皮黑素细胞迁移的影响 甘草提取物在浓度为1.25 mg/L时黑素细胞迁移与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但当浓度为2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L时黑素细胞迁移与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 甘草提取物对黑素细胞迁移的影响(±s)

表1 甘草提取物对黑素细胞迁移的影响(±s)

甘草提取物浓度(mg/L) 0(对照组) 1.25 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0人表皮黑素细胞迁移数28.667±3.750 28.583±2.282 25.367±2.433 25.403±2.518 25.667±1.986 23.167±3.033 22.235±4.122 t值(与对照组比较) P值(与对照组比较) 0.057 4 2.164 2 2.214 7 2.167 8 2.120 9 3.421 1 0.954 9 0.043 6 0.041 6 0.045 6 0.049 9 0.003 5

2.3 甘草提取物对人表皮黑素细胞内钙离子的影响 实验浓度下甘草提取物处理后均能降低人黑素细胞内钙离子的水平；不同浓度甘草提取物与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 不同浓度甘草提取物对体外培养黑素细胞细胞内钙离子的影响

3 讨论

黑素细胞起源于神经嵴，其分化发育历经3个阶段：自胚胎发育2～5周时期开始，在细胞表面受体家族整合素的作用下，神经嵴细胞不断地发生迁移，在此过程中可转化为成黑素细胞、黑素细胞并移行其适宜的生存环境-表皮基底层及毛囊。黄褐斑、雀斑以及日光性损伤等色素障碍性皮肤病由于黑素颗粒过多聚集引起。黑素细胞的迁移在其发病中其重要作用。细胞迁移对胚胎发育、伤口愈合、白细胞吞噬、恶性肿瘤细胞侵袭和转移具有非常重要的意义[5]。甘草的化学组成较为复杂，目前为止从甘草中分离出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、异甘草甙、新甘草甙等数十种化合物，但其中的主要成分为甘草甜素和甘草次酸。祖国医学认为甘草具有补脾益气、清热解毒、止咳祛痰、调和诸药的功效。西方医学认为甘草还具有抗炎、杀菌和美白、抗氧化和清除自由基作用。有研究发现甘草有抑制黑素细胞酪氨酸酶和黑素瘤细胞黑素合成的作用。本研究用目前常用的Transwell微孔滤膜法检测体外培养黑素细胞迁移，研究表明：甘草提取物在浓度为1.25 mg/L时黑素细胞迁移与对照组比较差异无统计学意义，但当浓度为2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L时黑素细胞迁移与对照组比较差异均有统计学意义。但浓度继续增大对于黑素细胞的影响，我们目前的实验未涉及，我们将在今后的试验中扩大甘草提取物浓度范围，以全面、系统地分析其对黑素细胞调控作用。

在细胞中，钙是重要的第二信使，通过其可调节细胞迁移活动[6]。本实验通过激光共聚焦系统检测细胞内[Ca2+]i浓度的变化，研究甘草提取物对黑素细胞迁移及细胞内钙离子的影响。通过激光共聚焦显微镜，可观察亚细胞水平上Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。研究结果提示：实验浓度下甘草提取物处理后均能降低人黑素细胞内钙离子的水平；不同浓度甘草提取物与对照组相比较差异均有统计学意义。显示甘草提取物可促进细胞内钙离子的降低，推测可能是甘草提取物某些成分可组织钙离子与细胞胞膜受体结合后激活磷脂酶C(PLC)，进而减少PLC分解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸生成二酯酰甘油(DAG)、肌醇-1，4，5三磷酸(IP3)的能力。减少IP3与受体结合，使细胞内储存的Ca2+释放减少。

本研究未发现较高浓度的甘草有细胞毒性作用。通过以上数据我们推测甘草提取物中某些成分可能通过诱导细胞内Ca2+降低从而抑制黑素细胞迁移，为化妆品及药物的研发提供更多的理论依据。

[1]Fu Y,Chen J,Li YJ,et al.Antioxidant and anti-inflammatory activities of six flavonoids separated from licorice[J].Food Chem,2013, 141(2):1063-1071.

[2]Yokota T,Nishio H,Kubota Y,et al.The in hibitory effect of ab ridin from licorice extracts oll melanogenesis and inflammation[J]. Pigment Cell Res,1998,11(6):355-361.

[3]张迪敏,洪为松,傅丽芳,等.个体化培养自体黑素细胞移植治疗白癜风[J].中华皮肤科杂志,2010,43(10):721-725.

[4]Abdul-Wahid A,Huang EH,Cydzik M,et al.The carcinoembryonic antigen IgV-like N domain plays a critical role in the implantation of metastatic tumor cells[J].Mol Oncol,2014,8(2):337-350.

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[6]Komuro H,Kumada T.Ca2+transients control CNS neuronal migration[J].Cell Calcium,2005,37(5):387-393.

Effects of licorice extract on migration and[Ca2+]i in human melanocytes in vitro.

LI Wen,NIU Mu,HUANG Rui-ye.
Department of Dermatologic Surgery,Hainan Provincial Center for Skin Disease and STI Control,Haikou 570206,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of licorice extract on migration and[Ca2+]i in human melanocytes in vitro．MethodsHuman melanocytes,obtained from normal foreskins,were treated with licorice(the study group)and equivalent medium(the control group).Cell migration was assessed using the transwell micropore filter method,and[Ca2+]i was detected by confocal laser scanning microscope.ResultsWhen the concentration of licorice extract was higher than 1.25 mg/L,the migration number of melanocyte was statistically significantly different from that of the control group(P＜0.05).After treatment with the experimental concentration of licorice extract,[Ca2+]i levels in the human melanocytes were significantly reduced.The effect of different concentrations of licorice extract on [Ca2+]i showed statistically significant difference with that of the control group(P＜0.05).ConclusionLicorice extract inhibite the melanocyte migration through reducing the concentration of[Ca2+]i.

Melanocyte;Licorice extract;Migration;[Ca2+]i

R284.2

A

1003—6350（2015）13—1876—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.13.0676

2015-01-21)

黎 雯。E-mail：lw1025325@163.com