离子液体超声波辅助法提取杜仲皮总木脂素的工艺研究

史丽娟，彭胜，郑阳，王志宏，彭密军

(吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，杜仲湖南省工程实验室，湖南 张家界 427000)

离子液体(IL)近年来被越来越多的学者应用于提取领域。Zhang［1］用［C4mim］［PF6］超声波辅助法提取厚朴中厚朴酚，Du［2］用酸化［C4mim］Br 微波辅助法提取杨梅中杨梅黄酮和槲皮素，Yang Lei［3］用［C4mim］Br 超声波辅助法提取刺五加中的刺五加苷b 和e。

杜仲系杜仲科杜仲属多年生落叶乔木植物，其性甘、味微辛，具有提高机体抗缺氧耐力［4-5］等功效。杜仲中的主要活性成分包括环烯醚萜［6］、木脂素类［7］、苯丙素类［8］和黄酮类等［9］。其中木脂素类化合物具有抗肿瘤、舒血管作用［10］和降血压作用［11-12］等活性。已报道的杜仲木脂素类化合物有28 种［13-15］，例如松脂醇二葡萄糖苷(PDG)。本实验采用离子液体超声波辅助法提取杜仲皮总木脂素，用响应面法对工艺条件进行优化，以期为杜仲的工业生产提供一定参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

杜仲皮;离子液体［C2mim］Br、［C4mim］Br、［C6mim］Br、［C4mim］Cl、［C4mim］BF4均为化学纯;松脂醇二葡萄糖苷(PDG)、甲醇、变色酸、浓硫酸均为分析纯;蒸馏水。

XO-5200DT 超声波清洗机;U-3900 紫外可见分光光度计;AEG-220 万分之一天平;BM400 型数显电热恒温水浴锅。

1.2 杜仲皮总木脂素提取

杜仲皮50 ℃烘干，粉碎。准确称取2.00 g 杜仲皮粉于50 mL 锥形瓶中，加入浓度0.68 mol/L 的离子液体溶液，液料比15∶1 mL/g，充分搅拌后浸泡2 h。50 ℃下超声提取30 min。过滤，并定容到100 mL。测定吸光度，计算总木脂素得率。

1.3 标准曲线的制作［16］

准确称取PDG 标准品6.1 mg，用甲醇溶解，分别配制不同浓度的PDG 标准溶液(0. 0，95. 3，190.6，381.3，762.5，1 525.0，3 050.0 μg/mL)，用变色酸比色法［17-18］测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

杜仲皮总木脂素的测定方法同PDG 标准溶液。标准 曲 线 方 程A = 0. 000 2C + 0. 006 1，R2=0.999 5。A 为吸光度，C 为标准溶液浓度。线性范围95.3 ～3 050.0 μg/mL。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 ILs 种类对总木脂素得率的影响 实验条件为浓度0.68 mol/L，液料比15∶1 mL/g，浸泡时间2 h，提取温度50 ℃，提取时间30 min，提取1 次，考察ILs种类对杜仲总木脂素得率的影响，结果见表1。

表1 ILs 种类对总木脂素得率的影响Table 1 The influence of variety of ILs on the yield of total lignans

由表1 可知，从［C2mim］Br 到［C4mim］Br，总木脂素得率随着碳链长度的增加而增大，从［C4mim］Br到［C6mim］Br，总木脂素得率随碳链长度的增加而降低。这可能是因为碳链过短，空间位阻太小，溶出目标成分木脂素的同时也溶出大量非目标成分;碳链过长，空间位阻太大，不利于木脂素的溶出。所以选择［C4mim］+作为实验提取溶剂的阳离子。

ILs 中的阴离子主要控制水溶性，阴离子对木脂素的多重交互作用如ρ-ρπ 键、氢键、溶剂效应等各不相同，其水溶性也各不相同，因而对木脂素的水溶性也各不相同，盐在3 种离子液体中提取杜仲皮总木脂素的得率最高，选择［C4mim］BF4作为提取试剂。

2.1.2 液料比对总木脂素得率的影响 实验条件为0.68 mol/L［C4mim］BF4溶液，浸泡时间2 h，提取温度50 ℃，提取时间30 min，提取1 次，考察液料比对杜仲总木脂素得率的影响，结果见图1。

图1 液料比对总木脂素得率的影响Fig.1 The influence of liquid-solid ratio on the yield of total lignans

由图1 可知，总木脂素得率随着溶剂用量的增加而提高，当液料比超过15∶1 mL/g 后总木脂素得率无明显增加。这可能是因为杜仲皮的量一定，在一定程度上增大溶剂用量，会提高总木脂素得率，但当液料比过高时，杜仲组织中的总木脂素几乎全部溶出，故继续增大液料比，总木脂素得率增加不显著。因此，确定液料比为15∶1 mL/g。

2.1.3 ［C4mim］BF4浓度对总木脂素得率的影响实验条件为15∶1 mL/g［C4mim］BF4溶液，浸泡时间2 h，提取温度50 ℃，提取时间30 min，提取1 次，考察［C4mim］BF4浓度对杜仲总木脂素得率的影响，结果见图2。

图2 ［C4mim］BF4浓度对总木脂素得率的影响Fig.2 The influence of［C4mim］BF4’s concentrations on the yield of total lignans

由图2 可知，随［C4mim］BF4的浓度增加，总木脂素得率增长;［C4mim］BF4浓度＞0.68 mol/L，总木脂素得率变缓。其原因可能与溶液粘度有关。当浓度进一步增加，溶液粘度也会继续增大，［C4mim］-BF4继续渗透到杜仲组织的能力和总木脂素溶出的能力都降低，得率增加不显著。为节约成本，［C4mim］BF4浓度选0.68 mol/L。

2.1.4 提取温度对总木脂素得率的影响 实验条件为0. 68 mol/L［C4mim］BF4溶 液，液 料 比15∶1 mL/g，浸泡时间2 h，提取时间30 min，提取1次，考察提取温度对杜仲总木脂素得率的影响，结果见图3。

图3 提取温度对总木脂素得率的影响Fig.3 The influence of ultrasonic temperatureon the yield of total lignans

由图3 可知，随着提取温度的升高，总木脂素得率升高，＞50 ℃后变缓。这可能与超声波提取技术的基本原理有关。超声波产生的强烈振动、强烈空化效应、机械效应、热效应等能破坏杜仲组织细胞，增大溶剂的运动频率和速度，使溶剂渗透到杜仲组织细胞中，加速木脂素类物质间的溶出，从而增加总木脂素得率。但温度过高，对这些效应及其协同作用的贡献不大，因而其对总木脂素得率的贡献不明显。从总木脂素得率及节约能源的角度出发，提取温度为50 ℃。

2.1.5 提取时间对总木脂素得率的影响 实验条件 为0. 68 mol/L ［C4mim］BF4溶 液、液 料 比15∶1 mL/g，浸泡时间2 h，提取温度50 ℃，提取1次，考察提取时间对杜仲总木脂素得率的影响，结果见图4。

图4 提取时间对总木脂素得率的影响Fig.4 The influence of ultrasonic time on the yield of total lignans

由图4 可知，总木脂素得率随着提取时间的增加而增加，30 min 后降低。因为总木脂素从杜仲组织中溶出时需要一定时间，故而延长超声提取时间，溶解度增大，总木脂素得率会增大，但提取时间过长，有些木脂素可能会发生分解反应，而杂质会继续溶出，从而使得木脂素的得率降低。从得率、节约能源、节约时间等方面考虑，提取时间为30 min。

2.1.6 浸泡时间对总木脂素得率的影响 实验条件 为0. 68 mol/L ［C4mim］BF4溶 液，液 料 比15∶1 mL/g，提取温度50 ℃，提取时间30 min，提取1次，考察浸泡时间对杜仲总木脂素得率的影响，结果见图5。

图5 浸泡时间对总木脂素得率的影响Fig.5 The influence of soaking time on the yield of total lignans

由图5 可知，总木脂素得率随着浸泡时间的增加而增加;2 h 后，总木脂素得率逐渐趋于平缓。这可能是因为溶剂渗透到杜仲组织和总木脂素从杜仲组织中溶出均需要一定时间，故适当延长浸泡时间，总木脂素得率会增加;继续延长浸泡时间，溶剂渗透到杜仲组织和总木脂素从杜仲组织中溶出的过程都达到平衡，故得率增加不显著。因此，浸泡时间选2 h。

2.1.7 提取次数对总木脂素得率的影响 实验条件为0. 68 mol/L［C4mim］BF4溶 液，液 料 比15∶1 mL/g，浸泡时间2 h，提取温度50 ℃，提取时间30 min，考察提取次数对杜仲总木脂素得率的影响，结果见表2。

表2 提取次数对总木脂素得率的影响Table 2 The influence of number of extractioncycles on the yield of total lignans

由表2 可知，随提取次数的增加，杜仲总木脂素得率增加不显著，因此，提取1 次即可。

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面实验结果 参照单因素实验结果，根据Box-Behnken 的设计原理，确定［C4mim］BF4浓度、液料比和提取温度3 个因素为影响杜仲总木脂素得率比较显著的因素，对其进行3 因素3 水平实验设计。各因素水平见表3，实验结果见表4。

表3 响应面因素水平表Table 3 Factors and levels of RSM analysis

表4 响应面实验结果Table 4 The experiment results of RSM

回归模型为:Y =29. 161 54A +0. 776 41B +0.468 54C－0.260 58AB+0.511 06AC－3.010 00E-003BC－133.006 66A2－0.015 576B2－4.744 00E-003C2－11.537 90。其方差分析见表5。

表5 二次回归模型方差分析Table 5 Variance analysis for the regression model

由表5 可知，该回归模型F =28.27，概率P =0.000 1 ＜0.01，表明模型显著，该实验方法可行;确定系数R2=0.97，调整确定系数Radj2=0.94，说明回归模型拟合度较好，线性关系比较好;失拟项F =4.10，概率P =0.10 ＞0.05，表明失拟项不显著，那些未知因素对本实验结果干扰比较小，可用该模型代替真实实验点对实验结果进行分析;变异系数c.v. =1.78%，说明该回归模型精密度比较好。由表5 以及回归模型知，3 个因素对总木脂素得率的影响顺序为:［C4mim］BF4浓度＞液料比＞提取温度。

杜仲皮总木脂素得率的响应曲面图见图6。

图6 两两交互作用与总木脂素得率的三维响应面图Fig.6 Response surface plots for the interation of two factors on the yield of total lignans

2.2.2 验证实验 根据Box-Behnken 实验结果以及回归模型，利用Design Expert 8.0.6 软件，得到最佳工艺条件:0.87 mol/L［C4mim］BF4溶液，液料比18.27∶1 mL/g，浸泡时间2 h，提取温度54.28 ℃，提取时间30 min，提取1 次。考虑到实验方便可行，改为0.87 mol/L［C4mim］BF4溶液，液料比18∶1 mL/g，提取温度54 ℃，提取时间30 min，浸泡时间2 h，提取1 次。重复3 次，得率为11.03%，RSD=0.41%。表明该工艺重现性好。

2.3 与普通溶剂、传统提取法的比较

采用乙醇-超声辅助提取法［16］提取得到的杜仲总木脂素得率为7. 83%;采用乙醇-热回流提取法［19］得到的杜仲总木脂素得率为10.07%;用［C4mim］BF4-超声波辅助法提取得到的杜仲总木脂素得率为11.03%，比用乙醇热回流法高9.53%，但缩短了83 min，说明离子液体超声辅助提取法是一种快速、高效的提取法;比用乙醇超声波辅助法提取时高40.87%。这是因为将离子液体用作溶剂时，超声的空化效应能加速离子液体［C4mim］BF4穿透植物组织，促进植物组织内的木脂素类物质溶出，且［C4mim］BF4为阳离子表面活性剂，对杜仲皮总木脂素有增溶作用，同时［C4mim］BF4可能作为一种运载体将木脂素从植物细胞内运出，增大了其溶出率，从而提高了杜仲总木脂素得率。这也可能是因为［C4mim］BF4的溶剂效应很强，对糖苷的溶出起着关键性的作用。也可能是氢键和p-p π 键共同作用，有利于含糖苷和苯环等结构的木脂素的溶出。

3 结论

用离子液体超声波辅助法提取杜仲皮总木脂素较优的离子液体为［C4mim］BF4，最优的提取工艺为:浓度0. 87 mol/L［C4mim］BF4溶液，液料比18∶1 mL/g，浸泡时间2 h，提取温度54 ℃，提取时间30 min，提取1 次，得率为11.03%。该工艺提取时间短、能耗低、操作简便、提取效率高、所需溶剂少，为杜仲资源的深度开发利用提供了一定的依据。

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