BML-111对野百合碱致大鼠肺组织白介素-1β和组织因子的影响

陈永梅，张昭勇，陈 玲，龚兴瑞，向 勇

(湖北医药学院附属太和医院检验科1、麻醉科2，湖北 十堰 442000)

BML-111对野百合碱致大鼠肺组织白介素-1β和组织因子的影响

陈永梅1，张昭勇1，陈 玲1，龚兴瑞2，向 勇2

(湖北医药学院附属太和医院检验科1、麻醉科2，湖北 十堰 442000)

目的观察脂氧素受体激动剂BML-111处理对野百合碱(MCT)导致大鼠肺动脉压力的改变情况。方法SD大鼠36只，按照随机的原则分为C组、P组和B组，每组各12只，P组和B组皮下注射野百合碱50µg/g，C组皮下注射相等容量的生理盐水，B组腹腔注射1 mg·kg-1·d-1BML-111持续28 d。测量三组SD大鼠的平均肺动脉压力(MPAP)、右心室收缩压(RVSP)及右心室(RV)/[左室(LV)+室间隔(S)]比值，记录肺组织白介素1β(IL-1β)和组织因子(TF)的水平。结果P组和B组大鼠的MPAP、RVSP、RV/(LV+S)、肺组织IL-1β及TF水平均高于C组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；B组大鼠的MPAP、RVSP、RV/(LV+S)、肺组织IL-1β及TF水平均低于P组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论脂氧素受体激动剂BML-111可有效抑制野百合碱导致的大鼠肺动脉压力升高，其原理可能与减轻肺组织IL-1β及TF水平有关。

BML-111；野百合碱；白介素-1β；组织因子

肺动脉压力升高在临床比较常见，其原因多种多样，但是其本质仍然是肺血管结构和生理功能的紊乱，表现为肺动脉压力的逐渐升高，并最终导致右心衰竭和死亡。肺动脉高压危害如此之大，但是其发生机制并不清楚，预后不良，需要进一步的探索其发生发展机理[1]。随着该疾病研究的深入，炎症方面的影响正逐步得到关注，炎症因素可以导致肺血管功能紊乱、内皮细胞异常增殖，平滑肌细胞过度增生，并最终引起肺部细小动脉管腔狭窄，肺血管病变形成[2]。野百合碱(MCT)是一种较常用的致肺部炎物质，进而导致大鼠肺动脉血管病变并管腔狭窄，越来越多的被用来制作炎症性肺动脉高压模型[3]。BML-111是一种脂氧素类似物，它与血管内的受体结合后可抑制炎症反应，减少血管炎症相关性重塑，其药理作用特点可能成为较好的肺动脉高压治疗药物。此试验拟观察BML-111对MCT致大鼠肺动脉高压大鼠的作用及其机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从湖北医药学院动物实验中心订购雄性健康SD大鼠36只，体重200～230 g。实验器材准备包括：天平、注射器、压力换能器、水合氯醛、肝素、氟哌利多等大鼠试验用器械。MCT购自Sigma公司，白介素-1β(IL-1β)和组织因子(TF)酶联免疫试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肺动脉高压模型建立 实验分组及方法同前[4]，将36只大鼠平均分为C组、P组、B组，每组各12只。P组和B组大鼠皮下注射野百合碱50 mg/kg，C组注射相等容量生理盐水作为对照建立模型；继之B组腹腔注射1 mg·kg-1·d-1BML-111持续28 d。于大鼠MCT给药前，给药后第7天、第14天、第21天、第28天测量大鼠体重。

1.2.2 肺动脉压力测量 取10 cm硬膜外导管末端加热拉伸，并使其弯曲，用注射器注水验证导管通畅作为肺动脉压力测量用。4周时大鼠体制测量完毕后对大鼠进行压力测定实验，麻醉大鼠采用水合氯醛腹腔注射,剂量为3 ml/100 g(100 ml水合氯醛+ 5 mg氟哌利多)。麻醉后固定大鼠于手术台，分离右侧颈外静脉，远心端结扎静脉，近端插入提前制作好的预先充满肝素盐水的右心导管，联接至监护仪并察看压力数值及波形，当导管进入右心室压力稳定后记录其右室收缩压(RVSP)，监护仪出现肺动脉波形时，待其压力稳定后，记录平均肺动脉压力(MPAP)，每个压力值测量3次，每次间隔3 min。压力测量完毕后处死大鼠，游离右室(RV)和左室+室间隔(LV+S)并称重。

1.2.3 炎症因子的测定 在肺动脉压力测量完成后处死大鼠并取肺组织保存于-80℃冰箱。炎性因子检测时将肺组织匀浆后按照试剂盒要求，采用酶联免疫吸附法检测肺组织IL-1β和TF水平。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，本组计量资料以均数±标准差(±s)表示，对各组大鼠体重变化的比较采用重复测量资料方差分析，对血流动力学改变和肺肺部炎症因子的情况采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠存活情况 P组有两只大鼠于第3周死亡。四周结束后，P组和B组大鼠与C组比较，进食减少、少动，生长较慢，且P组比B组更严重。三组大鼠之间体重增长速度存在差异，C组增长最快，B组次之，P组最慢(F=6.2，P＜0.05)，见表1。

表1 三组大鼠体重变化比较(g，±s)

表1 三组大鼠体重变化比较(g，±s)

注：a表示与C组比较，P＜0.05；b表示与P组比较，P＜0.05。

组别C组P组B组28 d 330±15 253±14a290±14ab0 d 202±9 206±10 204±9 7 d 238±12 218±10a222±11a14 d 272±13 230±11a250±12ab21 d 305±13 241±12a272±12ab

2.2 血流动力学结果 大鼠处死后发现，P组和B组大鼠MPAP(qP：C=11.2，qB：C=5.2)、RV/(LV+S)(qP：C= 14.6，qB：C=7.2)、RVSP(qP：C=9.8，qB：C=4.6)均较C组升高，且P组比B组升高明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 三组大鼠的MPAP、RVSP及RV/(LV+S)比较(±s)

表2 三组大鼠的MPAP、RVSP及RV/(LV+S)比较(±s)

注：a表示与C组比较，P＜0.05；b表示与P组比较，P＜0.05；1 mmHg= 0.133 kPa。

组别RV/(LV+S) MPAP（mmHg）RVSP（mmHg）C组P组B组17.2±2.2 34.6±5.8a26.9±4.5ab19.2±3.6 54.6±8.8a41.2±8.1ab0.223±0.024 0.395±0.036a0.312±0.031ab

2.3 IL-1β和TF含量 P组和B组大鼠肺组织IL-1β(qP：C=21.4，qB：C=12.2)和TF(qP：C=16.3，qB：C=9.6)含量相比C组增高，且P组比B组增加更明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 三组大鼠肺组织IL-1β和TF的含量比较(pg/ml，±s)

表3 三组大鼠肺组织IL-1β和TF的含量比较(pg/ml，±s)

注：a表示与C组比较，P＜0.05；b表示与P组比较，P＜0.05。

测量指标TF IL-1β19.8±6.4 53.6±10.2a38.8±8.4abC组P组B组67.5±17.6 256.8±70.4a144.47±47.8ab

3 讨 论

临床有众多疾病最后发展成为肺动脉高压，其过程较长，为治疗提供了时机，但是机制不清楚为临床治疗埋下了隐患。随着认识的越来越深入，炎症因素正得到越来越多的认可，诸如白细胞浸润、白介素释放、肿瘤坏死因子释放等。这些炎症介质是导致肺血管发生形态学改变的基础，如果对炎症不加以控制，任由其发展，各种因素很快导致并最终形成肺动脉高压[5-8]。因此从调控机体自身炎症反应途径来控制炎症反应具有重要意义。脂氧素是机体自身存在的促炎消退介质，作用于其受体可发挥抗炎作用，因此运用这条途径调控炎症反应具有重要意义，由于其在体内作用时间短暂，因此采用其受体激动剂BML-111，可发挥相似作用。本实验中采用较为常用的皮下注射MCT的方法成功制作大鼠肺动脉高压模型，实验期间大鼠在注射MCT后，P组大鼠生长速度明显减慢，MPAP、RV/(LV+S)、RVSP相比C组升高说明P组大鼠出现了肺动脉高压。由ELISA法检测发现肺组织IL-1β和TF含量均较正常对照组升高，说明MCT注射后诱发大鼠肺组织产生了明显的炎症反应；而B组大鼠在MCT注射后，4周内连续采用1 mg·kg-1·d-1剂量的BML-111腹腔注射，试验发现MPAP、RV/(LV+S)、RVSP升高幅度小于P组，进一步说明BML-111具有抑制MCT诱导大鼠肺动脉压力升高的作用。ELISA分析发现B组大鼠肺组织IL-1β和TF的升高幅度与P组相比明显减轻，说明B组肺动脉压力升高较小的原因可能与BML-111减轻肺组织IL-1β和TF水平有关，减轻了炎症所导致的肺血管重构，与Wang等[5]研究结果相一致，通过TNF-α阻断剂可有效抑制肺动脉高压，进一步说明了炎症反应在肺动脉高压形成中具有重要作用[1]。

IL-1β是机体重要的炎性介质，它可以激活机体的炎症反应，在肺动脉高压大鼠体内升高，同时大量的炎症细胞浸润[9]。具体过程与TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1、金属基质蛋白酶表达增强有关，并最终导致血管增生重构[10]。TF作为外源性凝血途径的启动因子启动凝血途径在肺动脉高凝状态和微血栓形成具有重要作用，抗凝治疗可改善肺动脉高压患者病情[11]。但是其更为重要的作用是促进肺动脉平滑肌细胞增殖而非改变凝血状态[12]。已有不少关于TF介导肺动脉高压发生发展的研究[13-14]，因此采用IL-1β和TF观察MCT处理后大鼠肺部炎症变化情况是可靠的。

由MCT诱导的大鼠肺动脉高压动物模型比较成熟，其病理改变包括平滑肌细胞增生，成纤维细胞激活并浸入血管中膜、内膜，并释放血管活性物质，动脉血管收缩障碍，动脉壁增厚，并最终产生肺动脉高压[5]，结果可靠，是常用的建立肺动脉高压的模型的方式。本实验通过观察发现，脂氧素受体激动剂BML-111通过减轻肺组织炎症反应相关因子IL-1β和TF，抑制MCT诱导大鼠肺动脉压力升高的速度，减轻大鼠肺血管结构改变程度。其通过抑制炎症从而改善肺动脉高压作用为临床治疗肺动脉高压提供了理论支持，具有较好应用前景。

[1]Dorfmuller P,Perros F,Balabanian K,et al.Inflammation in pulmonary arterial hypertension[J].Eur Respir J,2003,22(2)：358-363.

[2]Humbert M,Montani D,Perros F,et al.Endothelial cell dysfunction and cross talk between endothelium and smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension[J].Vascul Pharmacol,2008,49(4-6)：113-118.

[3]Gomez-Arroyo JG,Farkas L,Alhussaini AA,et al.The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2012,302(4)：363-369.

[4]龚兴瑞,陈永梅,向 勇,等.脂氧素受体激动剂BML-111对左向右分流型肺动脉高压大鼠作用的影响[J].海南医学,2013,24(2)：160-162.

[5]Wang Q,Zuo XR,Wang YY,et al.Monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension is attenuated by TNF-alpha antagonists via the suppression of TNF-alpha expression and NF-kappaB pathway in rats[J].Vascul Pharmacol,2012,58(1-2)：71-77.

[6]Price LC,Wort SJ,Perros F,et al.Inflammation in pulmonary arterial hypertension[J].Chest,2012,141(1)：210-221.

[7]Kherbeck N,Tamby MC,Bussone G,et al.The Role of inflammation and autoimmunity in the pathophysiology of pulmonary arterial hypertension[J].Clin RevAllergy Immunol,2011,44(1)：31-38

[8]Sakao S,Tatsumi K,Voelkel NF.Endothelial cells and pulmonary arterial hypertension：apoptosis,proliferation,interaction and transdifferentiation[J].Respir Res,2009,10(1)：1-10.

[9]Pinto RF,Higuchi ML,Aiello VD.Decreased numbers of T-lymphocytes and predominance of recently recruited macrophages in the walls of peripheral pulmonary arteries from 26 patients with pulmonary hypertension secondary to congenital cardiac shunts[J].Cardiovasc Pathol,2004,13(5)：268-275.

[10]Roy S,Samanta K,Chakraborti T,et al.Role of TGF-beta1 and TNF-alpha in IL-1beta mediated activation of proMMP-9 in pulmonary artery smooth muscle cells：involvement of an aprotinin sensitive protease[J].Arch Biochem Biophys,2011,513(1)：61-69.

[11]Berger G,Azzam ZS,Hoffman R,et al.Coagulation and anticoagulation in pulmonary arterial hypertension[J].Isr Med Assoc J, 2009,11(6)：376-379.

[12]Cirillo P,Cali G,Golino P,et al.Tissue factor binding of activated factorⅦ triggers smooth muscle cell proliferation via extracellular signal-regulated kinase activation[J].Circulation,2004,109(23)：2911-2916.

[13]White RJ,Galaria II,Harvey J,et al.Tissue factor is induced in a rodent model of severe pulmonary hypertension characterized by neointimal lesions typical of human disease[J].Chest,2005,128(6 Suppl)：612-613.

[14]White TA,Witt TA,Pan S,et al.Tissue factor pathway inhibitor overexpression inhibits hypoxia-induced pulmonary hypertension [J].Am J Respir Cell Mol Biol,2010,43(1)：35-45.

Effect of BML-111 on IL-1β and TF in pulmonary tissue of rats induced by monocrotaline.

CHEN Yong-mei1, ZHANG Zhao-yong1,CHEN Ling1,GONG Xing-rui2,XIANG Yong2.Department of Clinical Laboratory1,Department of Anesthesiology2,Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo analyzes the effect of BML-111 in treatment of pulmonary arterial hypertension induced by monocrotaline(MCT).MethodsThirty-six SD rats were randomly divided into three groups(C group,P group and B group),with 12 rats in each group.Both P group and B group were processed subcutaneous injection of 50 μg/g monocrotaline,while C group received same volume of saline.B group was additionally treated with intraperitoneal injection of 1 mg·kg-1·d-1BML-111 from the day of monocrotaline injection.Mean pulmonary arterial pressure(mPAP),right ventricular systolic pressure(RVSP),ratio of right ventricle to the sum of left ventricle and interventricular septum[RV/(LV+S)],the pulmonary interleukin-1β(IL-1β)and tissue factor(TF)were observed and assayed.ResultsThe levels of MPAP,RVSP,RV/(LV+S),pulmonary IL-1βand TF in P and B groups were significantly higher than those in C group(P＜0.05),and the levels in B group were significantly lower than those in P group (P＜0.05).ConclusionBML-111 can improve pulmonary arterial hypertension,which may be attributed to the inhibitory the inflammation of pulmonary tissue.

BML-111;Monocrotaline;Interleukin-1β(IL-1β);Tissue factor

R-332

A

1003—6350（2015）11—1566—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.11.0561

2014-12-06)

十堰市科技局指导项目（编号：ZD20111016）

陈永梅。E-mail：346822733@qq.com