剪切力对间充质干细胞的细胞休眠状态的诱导作用

罗 伟，李 锋，熊 伟，高仕长 （.重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 40006;.华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北武汉 430000）

剪切力对间充质干细胞的细胞休眠状态的诱导作用

罗 伟1，2，李 锋2，熊 伟2，高仕长1（1.重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016;2.华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北武汉 430000）

目的探讨层流剪切力（LSS）对间充质干细胞（MSCs）增殖和凋亡的影响。方法 选择间充质干细胞（MSCs），并对其进行体外流体剪切力力学加载（生理范围内）;通过DNA合成了解增殖情况，采用流式细胞仪及PCR技术检测其凋亡情况。结果 在生理范围内的流体力学加载，细胞增殖与其加载力相关;该范围内的力学刺激对MSCs的凋亡起抑制作用。结论 生理范围内的流体剪切力诱导MSCs进入休眠状态。

间充质干细胞;剪切力;细胞周期抑制;凋亡

人体内环境的稳态很大程度上受到外部力学的调控［1］。血管系统在力的刺激下发生形变，进而引起血管内的血液发生流变［2］。该流变的产生是在应力下骨骼变形，导致骨小梁发生结构改变，进而导致流体力的产生，其流变包括层流剪切力（fluid shear stress，LSS）。该流变刺激血窦成骨细胞和破骨细胞。现阶段对成骨细胞和破骨细胞的力学影响已有详尽的研究，然而对其来源细胞－间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）还没有充分的研究［3-4］。人体内的MSCs有分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞的潜能［5］。处于血窦旁的MSCs能感应到流变力学的刺激［6］。流变力学在人体内的加载范围为 8～30 dynes/cm2［7-8］。

间充质干细胞多向分化能力为组织工程的种子细胞奠定基础，在修复梗死的心肌及机体免疫调节方面发挥重要作用。目前的研究多集中在分化能力本身，在力学影响方面的关注较少。我们假设MSCs可以感受生理范围内的LSS的刺激，探讨生理范围内的LSS对细胞周期和细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM/F-12培养基（Hyclone公司，美国）;胎牛血清（Gibco公司，美国）;胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（Amersco公司，美国）;Annexin V-FITC免疫荧光凋亡检测试剂盒（北京中山公司）;实验动物为4～5周龄Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量100～150 g，由北京大学医学院实验动物中心提供。

1.2 方法

遵从北京大学医学部动物实验中心的伦理学法规。SD大鼠引颈处死后分离股骨，在股骨骨髓腔中取细胞进行培养。直到细胞达到融合状态（2周左右）。利用平行板流动腔装置进行LSS加载。平行板流动腔由Frangos首先采用，其原理由Daculis论证，在我们实验室中经过Ke Bai使用［9-11］。该力学加载为生理范围内，即1～15-dyne/cm2。待细胞融合后立即进行层流剪切力加载（1，5，15-dyne/cm2）。在不同的时间点进行检测，用Lowry方法进行验算。收集到（4～5）×105/L数量的间充质干细胞，用70%乙醇（冰）固定。经过RNase消化后，再由propidium iodide（PI）染色，最后进行检测。经过LSS力学加载后使用Annexin V-FITC免疫荧光凋亡检测试剂盒（步骤见试剂盒指南）。接受检测的细胞数量每次不低于（4～5）×105/L。用Invitrogen公司的Trizol提取RNA，来检测凋亡相关基因（Bcl-2和Bax）。采用PBG，来标准化mRNA的表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 LSS对MSCs DNA合成的影响

力学加载强度为1、5、15-dyne/cm2层流剪切力;时间检测点为0、4、12、24 h;加载15-dyne/cm2LSS 后 MSCs的 DNA 合成明显抑制。加载4 h后DNA的合成明显减少（64.3%），随后24 h继续减少（44.5%）。5-dyne/cm2LSS力学加载时细胞DNA合成受抑制。减低力学加载（1-dyne/cm2）未见明显的细胞增殖抑制。上述提示1-dyne/cm2和5-dyne/cm2之间的某个力学加载点，MSCs增殖抑制现象开始出现（图1）。

2.2 LSS对细胞周期的影响

对细胞加载生理范围内的LSS，我们可以发现处于增殖期的细胞比率（S-G2/M）随时间增加而下降。力学加载强度分别为:1、5、15-dyne/cm2层流剪切力;不同时间检测点为:0、4、12、24 h。在不同时间点数据如下:4 h为22.31%;12 h为13.64%;24 h为11.50%（图2）。

图1 时间相关的MSCs增殖抑制作用

2.3 LSS介导的细胞周期

细胞凋亡的验证是通过凋亡相关蛋白在细胞膜的表达进行检测。结构显示生理范围内的力学加载（LSS 15-dyne/cm2）对细胞凋亡起到抑制作用。不同的时间检测点为:0、4、12、24 h;在不同的时间点数据如下:4 h活细胞比率82.37%（对照组59.39%）;这一数据在24 h得到进一步维持（图3）。

2.4 MSCs凋亡相关基因（Bcl-2/Bax）表达

力学加载强度为1、5、15-dyne/cm2层流剪切力;检测点为12 h检测凋亡相关基因（Bcl-2/Bax）表达。结果显示生理范围内的层流剪切力对MSCs有抗凋亡作用。抗凋亡基因的表达增加，与促凋亡基因的比值（Bcl-2/Bax）随时间增加而增加（图4）。

3 讨论

本研究结果显示细胞体外培养中，LSS使MSCs增殖被抑制，同时抑制细胞凋亡。LSS通过影响MSCs进入S期来抑制其增殖，因为将G0/G1期的MSCs暴露在LSS之后，S期的细胞跟G2/M期的细胞数量都减少，提示层流剪切力是通过影响细胞进入S期来达到抑制细胞增殖。我们进一步的观察发现生理范围内的力学加载，细胞的线粒体代谢水平受到影响。通过检测细胞凋亡，发现表达在细胞外膜上的磷脂酰丝减少［12］（加载1 h减少30%，加载24 h减少40%）。我们再进一步检测凋亡调节基因（Bcl-2/Bax）的mRNA表达，LSS的处理使凋亡调节基因转向MSCs的存活率升高的一边，同时检测到Bcl-2的表达以及Bcl-2/Bax的比率增高。在LSS处理MSCs开始1 h后，上述作用开始出现，且呈时间依赖性。层流剪切力的加载导致细胞抗凋亡能力增加。基础研究证实细胞抗凋亡是通过调节p27来实现的，反映了其抗凋亡作用［13］。因此，我们认为LSS是MSCs在体外培养中的一个重要存活因素。

图2 层流剪切力对细胞周期影响

这些调节反应在过表达BCL-2或者BCL-x（L）的细胞中更加突出［14］。在流体力学的作用下，细胞的物质交换相对于静止细胞明显增加，这可能是该实验细胞低凋亡率的一个重要原因。Frisch教授团队发现整合素信号通路在细胞的生长和分化中起到重要作用［15］。也与 VEGF 及其受体表达相关［16］。我们的研究发现层流剪切力可能通过ERK信号旁路导致细胞骨架结构的改变，进而引起细胞周期的停滞。我们的研究和其他研究［17］都证实了生理范围内的层流剪切力对MSCs维持静息期以及保持干细胞池的作用，这为MSCs移植作为潜在方法治疗心肌坏死或者免疫抑制提供了重要的信息，因为血流将可能改变移植细胞的功能。

图3 LSS（15-dyne/cm2）对细胞凋亡的影响

图4 LSS对细胞凋亡（Bcl-2/Bax）的影响

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（编辑:左艳芳）

Laminar shear stress result in maintaining the quiescence of MSCs

LUO Wei1，2，LI Feng2，XIONG Wei2，GAO Shi-chang1（1.Department of Orthopedics，First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016;2.Department of Orthopedics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of laminar shear stress（LSS）on the proliferation and apoptosis of mesenchymal stem cells（MSCs）.MethodsThe influences of laminar shear stress（the physiological levels）on MSCs were studied.DNA synthesis and cell cycle were measured，to detect the cellular proliferation.The apoptosis-related gene expression（Bcl-2/Bax）was examined to determine the effect of LSS.ResultsThe percentage of MSCs’proliferation rate was reduced by the fluid shear stress.Furthermore，it was detected that LSS exerted a potent suppression effect on MSC apoptosis.ConclusionThese data revealed a critical role of LSS in maintaining the quiescence of MSCs.

mesenchymal stem cells;shear stress;cell cycle arrest;apoptosis

R329.25

A

1672-5042（2015）02-0123-04

10.11659/jjssx.01E015005

国家自然基金面上项目（30772206）

高仕长，电话:（023）89012566

2014-12-16

2015-01-20