16个紫花苜蓿品种维生素E含量测定与分析

冯光燕，高洪文，张新全，孙果丽，王学敏

（1．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；2．四川农业大学草业科学系，四川 雅安625014）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一种来自近东亚和中亚的优质多年生豆科牧草，有“牧草之王”的美誉，两千多年前由西域传入中国并开始了人工种植与利用［1］。紫花苜蓿营养价值极高，含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质和种类齐全的氨基酸［2］，具有优良的适口性、广泛的适应性和稳定的生产力，已经成为世界范围内分布最广和我国人工种植面积最大的豆科牧草［3］，在我国农牧业发展中起重要的作用。

维生素E（Vita min E，VE），又名生育酚，1922年由美国加州大学Her bert Evans发现，后经多年研究，分离出其生物分子结晶，并确定了其化学结构式为C29H50O2［4］。1924年，阿肯色大学的Sure首次命名为Vitamin E（VE）［5］。天然VE可分为生育酚（Toeopher ol）和生育三烯酚（Tocotrienol）两大类，根据芳香环上甲基的位置和数目的不同每一类又各有α、β、γ及δ四种类型［6］。VE 是一类只能由光合组织合成的脂溶性强抗氧化剂［7－8］，是维持人体和动物多种生理活动的重要物质，其主要功能体现在稳定不饱和脂肪酸，使其免受脂肪氧合酶的伤害［9］；清除体内自由基，延缓衰老［10］；保证精子和卵巢发育，维持正常的生殖功能等［11］，是人体和动物必须从食物中摄取的微量营养成分之一，具有重要的生物学功能［12－13］。VE 不仅在动植物多种生理活动中扮演关键角色，而且从农业和营养角度也有很重要的作用。研究认为，VE 作为生物抗氧化剂，可以提高机体免疫反应，抗毒，抗感染，抑制亚硝酸基的形成［14］；肉牛饲养中，添加VE 可以明显提高肌肉的红色度，延长肉品的货架期；奶牛日粮中添加VE可以明显提高牛奶的品质，抑制牛奶氧化过程，使其保持鲜奶具有的特殊香味并且大幅延长牛奶贮藏时间［15］等。

由于VE不能在人类和动物体内合成，必须通过食物等途径摄取［4］，而紫花苜蓿作为畜牧业最重要的豆科牧草之一，研究其VE 的含量及种类分布有非常重要的现实意义。目前，作物VE 的研究主要集中在油菜（Br assica ca mpestris）、水稻（Or yza sativa）、大豆（Gl ycine max）、棉花（Gossy piu m hir－sutu m）等［16－18］，而在重要牧草紫花苜蓿上研究还比较少。因此，本研究通过对16个紫花苜蓿品种叶片中VE含量及VE 各组分分布规律的研究，以期筛选高VE含量的紫花苜蓿资源，为紫花苜蓿的利用以及品质育种提供试验依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验所用的16个紫花苜蓿品种由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源室提供，分别是中苜1 号、雷达克之星、肇东（M．sativa cv．Zhaodong）、草原3号（M．sativa cv．Caoyuan No．3）、阿尔岗金（M．sativa cv．Algonguin）、新牧1 号（M．sativa cv．Xin mu－1）、公农2号（M．sativa cv．Gongnong No．2）、甘农1 号（M．sativa cv．Gannong No．1）、龙 牧803 （M．sativa cv．Long mu 803）、新疆大叶、三德利（M．sativa cv．Sanditi）、德宝（M．sativa cv．Debao）、乌拉特1 号（M．sativa cv．Wulate No．1）、金皇后（M．sativa cv．Golden Empress）、敖汉和保定（M．sativa cv．Baoding）。

2013年7月11日，每个苜蓿品种各选取50粒形态完整、大小一致的种子用于测试。种子先于50%乙醇中浸泡2 min，然后于5%的次氯酸钠中浸泡5 min，灭菌水清洗3 次。将灭好菌的紫花苜蓿种子播种于铺有灭菌滤纸的培养皿上，置于25 ℃（光／暗为12／12 h）光照培养箱内发芽，待长出2片叶子后转移至营养钵中（蛭石∶珍珠岩＝3∶1）于人工气候室中（光／暗为12／12 h）培养12周，每个品种3盆，每盆混取叶片3 g用于叶片VE含量的测定。

1．2 试验方法

1．2．1 VE 含量测定 叶片VE 含量委托北京市营养源研究所测定，参照Cahoon等［19］的方法，具体为：混取3 g 新鲜苜蓿叶片，研磨均匀后再取样0．03～0．05 g，加入1 mL甲醇∶氯仿（2∶1，V∶V）含2，6－二叔丁基对甲酚（BHT）0．01%，避光静置20 min。加入0．33 mL氯仿和0．6 mL 水，涡旋振荡，混匀后14 000 g离心10 min，取有机相（下层），蒸干。用二氯甲烷∶甲醇（1∶5，V∶V）溶解至400 μL，置于样品瓶中上机测定，进样量20μL。

采用外标法和定量分析测定VE，使用仪器为高效液相色谱仪（型号：Agilent 1260）；双泵系统（G1312B）；荧光检测仪（G1321B）；色谱柱为Li－CHrospher 100 Diol 250 mm×4 mm，粒径5μm；流动相，甲 醇∶水（97 ∶3，V ∶V）；流 速1．2 mL·min－1；荧光激发292 n m，发射330 n m。VE标准样品α－VE，β－VE，γ－VE，δ－VE 购自Sig ma公司。

1．2．2 统计分析 使用SAS 9．2统计软件中简单相关分析对维生素E（VE）总量与α－VE，α－VE 与γ－VE数据进行相关分析，使用SAS 9．2中ANOVA对不同品种苜蓿VE 含量进行方差分析，Excel 2007进行作图。

2 结果与分析

2．1 苜蓿品种VE含量分布特征

2．1．1 标准VE 图谱与标准曲线 测试所得δ－VE，γ－VE，α－VE 标准品分别在8．047，9．712，11．457 min 出现峰值，（图1－A），以峰面积为纵坐标（Y），维生素E含量为横坐标（X）计算得到α－VE 校正曲线Y＝6．08 X＋2．10，R2＝0．999 94；γ－VE 校正曲线Y＝3．31 X＋1．55，R2＝0．999 15和δ－VE校正曲线Y＝4．99 X＋0．50，R2＝0．999 08。

对16个苜蓿品种叶片中VE检测所示，各组分以α－VE 为主，δ－VE 和γ－VE 含量水平较低（图1－B），因此VE 各组分含量计算与统计以α－VE 和γ－VE为主。

图1 VE标准品图谱及样品VE图谱Fig．1 HPLC chr omatogram of VE calibr ation standar ds and samples

2．1．2 紫花苜蓿品种VE 总量分析 16个紫花苜蓿品种VE总量介于1．833～6．346 mg·100 g－1FW，平均含量为3．281 mg·100 g－1FW，极差4．513，标准差1．326，变异系数40．41%。主要分布区间在1．956～4．607 mg·100 g－1FW，主要分布区间的品种11个，占参试品种的68．75%。中苜1号VE总含量极显著高于其他15 个参试苜蓿品种（P＜0．01），达到6．346 mg·100 g－1FW；敖汉苜蓿VE总量最低，仅为1．833 mg·100 g－1FW（表1）。

2．1．3 苜蓿品种主要成分α－VE和γ－VE分析 通过 对参试品 种 的α－VE 和γ－VE 分 析 发 现，16 个 参试品种叶片中α－VE 含量呈偏态分布，分布区域1．471～6．713 mg·100 g－1F W，平均含量3．050 mg·100 g－1F W，频率变幅1%～16%，标准差1．307，主要分布区间为1．743～4．361 mg·100 g－1FW，主要分布区间的品种占总参试品种的72．92%。其中中苜1 号α－VE 含量最高，达到5．992 mg·100 g－1FW，草原3号α－VE含量最低，仅为1．709 mg·100 g－1F W。从在VE 总量中所占的比例来看，参试的16个品种α－VE 含量占到VE总量的89．96%～96．96%，是VE 中的主要组分。其中三德利α－VE所占比例最高，达到98．60%，乌拉特1号α－VE所占比例最低，为89．95%。

16个参试品种叶片中γ－VE 含量呈偏态分布，分布区域0．021～0．204 mg·100 g－1F W，平均含0．064 mg·100 g－1F W，频率变幅1%～17%，标准差0．042，主 要 分 布 区 间 为0．025 ～0．108 mg·100 g－1F W，主要分布区间的品种占参试品种的81．82%。其中乌拉特1 号和保定苜蓿γ－VE 含量最高，达到0．147 mg·100 g－1F W，新疆大叶苜蓿γ－VE 含量最低，仅为0．024 mg·100 g－1F W。从在VE总量的比例来看，参试的16个品种γ－VE含量占VE 总量的0．93%～6．84%，远低于α－VE的含量。

VE总量与α－VE 和γ－VE相关性分析表明，VE总量与α－VE，α－VE与γ－VE含量呈极显著正相关（P＜0．01），而VE总量与γ－VE含量则无显著相关关系。

表1 不同品种苜蓿叶片中VE含量分布Table 1 Distribution of VE contents of 16 M．sativa varieties leaves

2．2 高VE苜蓿资源的鉴定

目前国内外尚无关于紫花苜蓿VE含量的分类标准，所以数据分析时参照李国营等［20］提出的谷子高VE含量分类标准，以样品VE 总含量的平均值及其标准差±s，n＝16）为分类依据，由Excel软件统计分析，16 份参试品种叶片VE 总量平均值（）为3．281 mg·100 g－1F W，标准差（s）为1．326，则＋s）为4．607 mg·100 g－1F W，－s）为1．955 mg·100 g－1F W。便于统计，计算结果按数值修约规则（GB 8170－1987）中0．5单位修约规定（即将修约间隔指定数位修约到0．5 单位）修约［20］。得到高VE 总量阈值≥4．61 mg·100 g－1F W，低VE总量阈值≤1．96 mg·100 g－1F W，中等VE 总量阈值为1．96～4．61 mg·100 g－1F W。依据上述标准，对参试苜蓿品种进行分类（图2），所有16 个参试苜蓿品种中，VE 总量大于4．61 mg·100 g－1F W 的高VE 苜蓿品种有3个，分别是中苜1号、雷达克之星和新疆大叶苜蓿，占参试品种的18．75%；VE总量在1．96～4．61 mg·100 g－1FW 之间的中等VE苜蓿品种有11个，分别是肇东苜蓿、阿尔岗金、新牧1号、公农2号、甘农1号、龙牧803、三德利、德宝、乌拉特1号、金皇后和保定苜蓿，占参试品种的68．75%；低于1．96 mg·100 g－1FW 的低VE苜蓿品种有2个，草原3号和敖汉苜蓿，占参试品种的12．5%。

图2 16个紫花苜蓿品种VE含量及分类Fig．2 Classes and distribution of VE content of 16 M．sativa varieties

3 讨论

本研究通过对16个紫花苜蓿品种叶片中所含VE含量进行测定和分析显示，参试品种中VE 总量介于1．833～6．346 mg·100 g－1F W，平均总含量为3．281 mg·100 g－1F W，与Winifired 等［21］1983年测定的3．122～9．467 mg·100 g－1F W 相比，含量明显偏低，出现这一差异的原因可能是本研究采用的是新鲜叶片作物测试材料，而Winifred等［21］则通过苜蓿草粉来测试不同品种的VE 含量（新鲜样品中由于有大量水分可能会影响维生素E的总含量）。Munné－Bosch 等［22］的研究认为，植物不同生长时期体内的VE 含量会呈现明显的变化，幼苗期植物体内的VE 含量会随着时间而不断积累，所以测定VE含量应该注意时期的选择。

结合我国的苜蓿品种区域划分以及各种植区适宜的苜蓿品种［23］，对参试国内紫花苜蓿品种的VE含量测定结果进行了分析（表2），结果显示，来自黄淮海苜蓿种植区的参试品种总VE 含量最高，变异范围在3．027～6．346 mg·100 g－1F W，平均值为4．687 mg·100 g－1F W；来自内蒙古高原种植区的参试品种总VE 含量最低，变异范围在1．833～2．150 mg · 100 g－1F W，平 均 值 为1．959 mg·100 g－1F W。就α－VE 含量而言，同样是来自黄淮海苜蓿种植区参试品种的α－VE 含量最高，变异范围在2．761～5．992 mg·100 g－1F W，平均值为4．377 mg·100 g－1FW；来自内蒙古高原种植区的参试品种α－VE 含量最低，变异范围在1．709～1．934 mg·100 g－1FW，平 均 值 为 1．800 mg·100 g－1F W。γ－VE 的分布与α－VE 和总VE的结果相似，同样是来自黄淮海种植区的参试品最高，变异范围在0．059～0．147 mg·100 g－1F W，平均值达0．103 mg·100 g－1F W；与α－VE 和总VE的结果不同的是，γ－VE 含量最低的则是来自青藏高原苜蓿种植区的参试品种，变异范围在0．029～0．041 mg·100 g－1F W，平 均 值 仅 为0．035 mg·100 g－1F W 。可见，VE 各组分在地域上有较大差异，可能是在苜蓿品种的生长过程中，不同的地域和不同的生态条件下对其进行遗传选择的结果。

Abbasi等［24］研究认为，α／γ－VE 含量的增高可以提高植物对盐分胁迫的耐受性和抵抗力，郭娟等［25］的研究也表明，在拟南芥（Ar abidopsis thaliana）中过量表达VE 合成关键基因以提高VE 含量，增强了拟南芥对盐分胁迫的耐受能力。而以耐盐为选育目标的‘中苜1 号’无论是总VE 还是α－VE含量在所有参试品种中都是最高，这也间接的证明VE含量对提高苜蓿对盐分的耐受能力可能具有积极的作用，VE 含量是否可以作为耐盐苜蓿筛选的一个参考指标在今后的试验中可以进行更深入的分析。

表2 不同苜蓿产区参试品种中VE含量分布以及变异情况Table 2 Distribution and variation of VE contents of M．sativa from different alf alfa－growing areas

本研究还发现，α－VE是紫花苜蓿叶片中的主要组成 成 分，γ－VE 次 之，δ－VE 所 占 比 例 最 少，并 且α－VE与总VE 呈极显著正相关关系。由于在人及动 物 体 中α－VE 活 性 最 高［26－27］，而β－VE、γ－VE 及δ－VE的活性远低于α－VE［28－29］，因此，高α－VE 含量的紫花苜蓿品种能为家畜提供更多的α－VE，从而促进畜产品品质的改善与提高。

本研究通过对紫花苜蓿VE 含量和成分的分析，将参试的紫花苜蓿分成了3类：中苜1号、雷达克之星和新疆大叶苜蓿3个高VE 含量品种，11个中等VE含量的苜蓿品种以及2个低VE 含量的品种，通过对这些苜蓿品种的分类和 含量分布特征的分析，为今后苜蓿品质资源的挖掘和苜蓿品质的改良提供了有益的信息。

［1］ 苏加楷．苜蓿的适应性、分布和区划［C］．北京：第二届中国苜蓿发展大会暨牧草种子、机械、产品展示会，2003：13－15．

［2］ 王鑫，马永祥，李娟．紫花苜蓿营养成分及主要生物学特性［J］．草业科学，2003，20（10）：39－41．

［3］ 韩德梁，王彦荣．紫花苜蓿对干旱胁迫适应性的研究进展［J］．草业学报，2005，14（6）：7－13．

［4］ Evans H M，Bishop K S．On the existence of a hitherto unrecognized dietar y factor essential f orreproduction［J］．Science，1922，56：650－651．

［5］ Sure B．Dietary requirement f or reproduction II．The existence of a specific vitamin for reproduction［J］．Journal of Biological Chemistry，1924，58：693－709．

［6］ Ftyer M J．The antioxidant effects of thylakoid vitamin E（a－tocopherol）［J］．Plant，Cell and Environment，1992，15（4）：381－392．

［7］ Shintani D，DellaPenna D．Elevating the Vitamin E content of plants through metabolic ngineering［J］．Science，1998，282：2098－2100．

［8］ Tra Der M G，Sies H．Vitamin E in hu mans：Demand and deliver y［J］．Annual Review of Nutrition，1996，16（1）：321－347．

［9］ Erin A N，Skrypin V V，Tabidze I V，Kagan V E．For mation of alpha－tocopherol complexes with fatty acids：A hypothetical mechanis m of stabilization of bio membranes by vitamin E［J］．Biochi mica et Biophysica Acta，1984，774（1）：96－102．

［10］ Kruk J，Trebst A．Plastoquinol as a singlet oxygen scavenger inphotosystem Ⅱ［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2008，1777（2）：154－162．

［11］ Eiten miller R R，Vitamin E content of fats and oils－nutritional implications［J］．Food Technology，1997，51：78－81．

［12］ Brigelius－FlohéR，Traber M G．Vitamin E：Function and metabolism［J］．The FASEB Jour nal，1999，13（10）：1145－1155．

［13］ Fukuzawa K，Gehicky J M．Oxidation of a－tocophorol in micelles and liposo mes by t he hydroxyl，per hydroxyl，and superoxide free radicals［J］．Archives of Biochemistry and Biophysics，1983，226（1）：242－251．

［14］ 苏宁．鸡的维生素和微量元素需求［J］．中国家禽，1985，6（3）：12－14．

［15］ Descalzo A M，Rossetti L，Grigioni G，Irurueta M，Sancho A M，Carrete J，Pensel N A．Antioxidant status and odor profile in fresh beef fro m pasture or grain－fed cattle［J］．Meat Science，2007，75（2）：299－307．

［16］ 李晓晓．大豆维生素生物合成相关酶基因的克隆及对马铃薯的遗传转化［D］．北京：首都师范大学硕士论文，2007．

［17］ 邹礼平，高和平．棉花γ－生育酚甲基转移酶基因全长c DNA的克隆与序列分析［J］．江苏农业学报，2009，25（3）：490－493．

［18］ 刘敏轩，陆平．中国谷子育成品种维生E 含量分布规律及其与主要农艺性状和类胡萝卜素的相关性分析［J］．作物学报，2013，39（3）：398－408．

［19］ Cahoon E B，Hall S E，Ripp K G，Ganzke T S，Hitz W D，Coughlan S J．Metabolic redesign of vitamin E biosynthesis in plants f or tocotrienol production and increased antioxidant content［J］．Nature Biotechnology，2003，21（9），1082－1087．

［20］ 李国营，范志影，陆平，刘方，张为喜，朱志华．谷子初级核心种质生育酚的组分及其评价［J］．植物遗传资源学报，2009，10（3）：378－384．

［21］ Winifired M，Cort T S，Vicente E H，Waysek D W，Beverly D W．Vitamin E content of feedstuffs deter mined by high－perfor mance liquid chro matographic fluorescence［J］．Jour nal of Agricult ure and Food Chemistr y，1983，31（6）：1330－1333．

［22］ Munné－Bosch S，Weiler E W，Alegre L，Müller M，Düchting P．Alpha－tocopher ol may influence cellular signaling by modulating jas monic acid levels in plants［J］．Planta，2007，225（3）：681－691．

［23］ 杨青川．苜蓿种植区划及品种指南［M］．北京：中国农业出版社，2012：7－10．

［24］ Abbasi A R，Hajirezaei M，Hofius D，Sonnewald U，Voll L M．Specific roles of alpha－and gamma－tocopherol in abiotic stress responses of transgenic tobacco［J］．Plant Physiology，2007，143（4）：1720－1738．

［25］ 郭娟，刘小丽，李晓峰，陈双燕，金治平，刘公社．拟南芥VTE1过量表达可以增加维生素E 含量和提高烟草植株耐盐性［J］．应用与环境生物学报，2006，12（4）：468－471．

［26］ Kamal－Eldin A，Appelqvist L A．The chemistr y and antioxidant properties of tocopherols and tocolrienols［J］．Lipids，1996，31（7）：671－701．

［27］ Hosomi A，Arita M，Satoa Y，Kiyoseb S，Uedac T，Igarashib O，Araia H，Inouea K．Affinity forα－tocopherol transfer protein as a deter minant of the biological activities of vitamin E analogs［J］．FEBS Letter，1997，409（1）：105－108．

［28］ Sattler S E，Cheng Z，Della P D．From Arabidopsis to agriculture：engineering improved Vitamin E content in soybean［J］．Trends in Plant Science，2004，9（8）：365－367．

［29］ Della P D．Progress in the dissection and manipulation of vitamin E synthesis［J］．Trends in Plant Science，2005，10（12）：574－579．