7个绵羊和7山羊品种DLX3基因3′非编码区803A＞G突变的检测

古丽格娜，艾买提·买买提，於建国，杨会国，郝 耿，储明星，买买提明，潘章源，狄 冉，刘秋月

（1.新疆畜牧科学院畜牧研究所，新疆 乌鲁木齐 830000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室，北京 100193；3.新疆畜牧厅南山种羊场，新疆 乌鲁木齐 830001）

7个绵羊和7山羊品种DLX3基因3′非编码区803A＞G突变的检测

古丽格娜1，艾买提·买买提1，於建国1，杨会国1，郝 耿1，储明星2*，买买提明3，潘章源2，狄 冉2，刘秋月2

（1.新疆畜牧科学院畜牧研究所，新疆 乌鲁木齐 830000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室，北京 100193；3.新疆畜牧厅南山种羊场，新疆 乌鲁木齐 830001）

DLX3基因3′非编码区803A>G突变与法国Lacaune绵羊高繁殖力密切相关座位FecL高度连锁。本研究采用PCR-SSCP方法在具有不同繁殖力的7个绵羊品种（湖羊、小尾寒羊、洼地绵羊、杜泊、陶赛特、特克塞尔、德国美利奴羊）和7个山羊品种（济宁青山羊、贵州白山羊、金堂黑山羊、成都麻羊、辽宁绒山羊、波尔山羊、安哥拉山羊）中检测DLX3基因803A>G突变，探究该突变与绵羊和山羊高繁殖力的关联性。结果表明这14个绵羊和山羊品种都不存在c.*803A>G突变，提示DLX3基因的c.*803A>G突变对这14个绵羊和山羊的繁殖力没有显著影响。

绵羊；山羊；繁殖力；DLX3基因；PCR-SSCP

同源盒基因（distal-less homeobox gene，DLX3）是同源异型框转录因子DLX家族中的一员，DLX3基因在哺乳动物的上皮组织、骨组织及胎盘发育过程中发挥重要作用。DLX3被定位于人17号染色体q21-22区域，它是Wnt信号通路的下游基因，能通过调控EGFR、蛋白激酶等信号通路影响绒毛滋养层细胞等细胞类型的生长分化（Chui等，2013）。

Bodin等（2002）对Lacaune绵羊后代的排卵数进行统计分析，发现其平均每次排卵6.5枚，其中超过6枚的个体占统计总数的38.4%，研究认为在Lacaune绵羊中存在影响其排卵数的主效基因。Bodin等（2003）将该基因命名为FecL基因，该基因被定位在绵羊第11号染色体的一个2.6cM区间内。Drouilhet等（2009）对绵羊高繁殖力主效基因FecL进行了精细定位，发现FecL位于BM17132和DLX3这两个分子标记之间，在此区间内，FecLL突变与其中一种特殊单倍型紧密连锁，此单倍型可根据DLX3基因3′UTR内的一个SNP（c.*803A>G）进行预测，该SNP能对携带和非携带FecLL突变的绵羊进行分类，准确率高达99.5%，因此这个突变位点可作为绵羊多羔性状的一个分子标记。

目前国内还未见分析绵羊和山羊DLX3基因3′UTR的特殊SNP位点与羊高繁殖力相关联方面的报道。本文以繁殖力存在差异（耿彩霞等，2011；王金鑫等，2013）的14个绵羊和山羊品种为实验材料，采用PCR-SSCP方法检测DLX3基因3′非编码区c.*803A>G突变在7个不同绵羊和7个不同山羊品种中的分布情况，试图寻找与绵、山羊繁殖力相关的遗传标记。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取7个绵羊品种（湖羊、小尾寒羊、洼地绵羊、杜泊、陶赛特、特克塞尔、德国美利奴羊）和7个山羊品种（济宁青山羊、贵州白山羊、金堂黑山羊、成都麻羊、辽宁绒山羊、波尔山羊、安哥拉山羊），每个品种随机抽取选择20只生产母羊，采集颈静脉血样10 mL/只，柠檬酸葡萄糖抗凝，-20℃冻存。用酚-氯仿法提取全基因组DNA，TE缓冲液-20℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank公布的绵羊DLX3基因全长序列（FJ654646），利用Premier Primer 5.0和Oligo 7软件，在3′非编码区设计一对引物。引物序列：上游引物5′-CCCATGTACAGGACTTTGCAC-3′；下游引物5′-AGCTTACTGGAGGAGAGGAAG-3′。

1.2.2 PCR扩增

反应体系为20 μL，其中：Taq MIX 10 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板（50 ng/μL）2.5 μL，去离子水6.5 μL。扩增条件：95℃5 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃20 s，共34个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.2.3 SSCP分析

取PCR产物2 μL与变性剂7 μL混匀，98℃变性10 min，冰浴7 min。将变性后的PCR产物在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中常温电泳后进行银染，最后用凝胶成像仪拍照和分析。

1.2.4 测序

PCR产物经电泳鉴定后，用胶回收试剂盒（BBI，Canada）回收目标片段，纯化后交由北京华大生物技术有限公司用ABI PRISM 377 DNA自动测序仪进行序列测定。

2 结果与分析

2.1 羊DLX3基因的PCR扩增

DLX3基因片段的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增条带与预计片段大小 （167 bp）相符（图1），可直接进行SSCP分析。

图1 绵羊和山羊DLX3基因的PCR扩增

2.2 扩增片段SSCP分析

对14个绵羊和山羊品种DLX3基因的扩增片段分别进行SSCP分析，发现所扩增片段均不存在多态性，以湖羊为例，聚丙烯酰胺凝胶结果见图2。

图2 DLX3基因扩增片段的SSCP分析（湖羊）

2.3 绵羊和山羊DLX3基因扩增序列比对分析

仅对小尾寒羊和济宁青山羊扩增区域进行了测序，获得序列片段大小均为167 bp；对测序序列进行比对分析后发现，小尾寒羊和济宁青山羊扩增区域均没有c.*803A>G多态突变。

图3 DLX3基因3′非编码区c.＊803处位点碱基

3 讨论

试验所选择的7个绵羊品种和7个山羊品种中，主要涵盖了国内外较高产羔率的绵羊品种：湖羊、小尾寒羊、洼地绵羊，较低产羔率的绵羊品种：杜泊、陶赛特、特克塞尔、德国美利奴羊；以及较高产羔率的山羊品种：济宁青山羊、贵州白山羊、金堂黑山羊，较低产羔率的山羊品种：辽宁绒山羊、安哥拉山羊、成都麻羊、波尔山羊。关于这些在繁殖力性状上存在差异的绵、山羊品种，已广泛地被研究者视为探究羊繁殖力分子机制的重要材料；目前，BMPR1B、BMP15和GDF9等基因的遗传多态性已多次在绵、山羊品种中被探索，且均未达到区分各品种羊繁殖力水平差异的研究目的。

FecL是Bodin等研究者在法国Lacaune绵羊群体中发现的多羔主效基因座位，FecL是遗传方式已知的多羔主效基因Lacaune的突变体（Bodin等，1998），FecL提高排卵数的效应与BMPR-IB相似，具有加性效应，杂合子增加排卵数1.0枚，纯合子增加排卵数2.0枚。Lecerf等（2002）通过基因扫描将Lacaune定位在绵羊11号常染色体上。Drouilhet等（2009）利用全基因组扫描对FecL进行精细定位，将区间缩小到BM17132和FAM117A两个标记之间，通过与人的同源区域比对，发现在这两个标记之间的20个同源基因没有任何一个属于BMP信号通路系统，而目前已发现确认的所有多羔基因都属于BMP家族，因此对FecLL突变进行基因定位有助于发现调控排卵数的新通路。Drouilhet等（2009）并没有将FecLL定位到特定基因，但他们却发现了一个非常有用的SNP，通过这个SNP可以将Lacaune绵羊分成L/L、L/+及+/+三种基因型。在精细定位获得的区间内，FecLL突变与其中一种特殊单倍型紧密连锁，此单倍型可以根据位于此区间边缘的DLX3基因的3’UTR内的一个SNP（c.*803A>G，终止密码子后第803个碱基）进行预测。它与FecLL突变高度连锁不平衡，这个突变以99.5%的准确性能够预测动物是否携带FecLL高产基因。同时研究者还发现在175只未携带FecLL突变的绵羊中有106只绵羊DLX3基因3′非编码区803 bp处为AA基因型，65只为AG基因型，4只为GG基因型，三种基因型产羔数的估计育种值分别为+1.25± 11.5、+19±11.7和+32.3±5.25。这一结果表明DLX3基因3′非编码区803G等位基因与高产羔数高度相关。Drouilhet等（2013）通过高通量测序技术，将FecLL进一步定位在胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白(IGF2BP1)和β1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(B4GALNT2)两个基因上，通过后续验证表明FecLL位于B4GALNT2基因上，B4GALNT2基因导致卵巢特异蛋白糖基化是调控绵羊排卵数的全新机制。而先前的结果表明FecL基因的突变以不同方式影响卵巢功能，与+/+型母羊相比，L/L型母羊颗粒细胞中FSHR和STAR mRNA水平较高，卵泡期有LH峰值出现，雌激素显著增加，黄体期孕酮的水平较高，而外周循环中FSH浓度在两基因型间差异不显著，垂体中L/L型母羊ESR2 mRNA的表达量显著低于+/+母羊（Drouilhet等，2010）。

本研究在小尾寒羊、济宁青山羊等14个绵羊和山羊品种中都未检测到DLX3基因3′非编码区c. *803A>G突变。究其原因，一方面可能此突变在绵羊和山羊品种中的频率较低，本研究分析的样本数过少导致未能检出该突变；另一方面，该突变可能不是影响本研究所选绵、山羊的繁殖力差异主要因素。本研究只是对DLX3部分序列多态性进行了初步分析，下一步还需要扩大样本数或对DLX3全基因序列开展多态筛查。

[1]耿彩霞，冯涛，储明星，等.绵羊GDF9基因FecTT突变检测[J].安徽农业大学学报,2011,38(3):341～345.

[2]王金鑫，冯涛，储明星，等.山羊生长分化因子9基因FecTT突变检测[J].中国畜牧兽医,2013,40(3): 123～126.

[3]Bodin L,Elsen J M,Poivey J P,et al.Hyper-prolificacy in the French Lacaune sheep breed:a possible major gene[C].In:Proceedings of the 6th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Armidale,Australia.1998,（27）:11～14.

[4]Bodin L,San Cristobal M,Lecerf F,et al.Segregation of a major gene influencing ovulation in progeny of Lacaune meat sheep[J].Genet Sel Evol,2002,34(4):447～464.

[5]Bodin L,Lecerf F,Pisselet C,et al.How many mutations are associated with increased ovulation rate and litter size in progeny of Lacaune meat sheep?[C].In:Proceedings of the International Workshop on Major Genes and QTL in Sheep and Goat,Toulouse,INRA,France.2003:2～11.

[6]Chui A,Kalionis B,Abumaree M,et al.Downstream targets of the homeobox gene DLX3 are differentially expressed in the placentae of pregnancies affected by human idiopathic fetal growth restriction[J].Mol Cell Endocrinol,2013,377(1-2):75～83.

[7]Drouilhet L,Lecerf F,Bodin L,et al.Fine mapping of the FecL locus influencing prolificacy in Lacaune sheep[J].Anim Genet,2009,40(6):804～812.

[8]Drouilhet L,Mansanet C,Sarry J,et al.The highly prolific phenotype of Lacaune sheep is associated with an ectopic expression of the B4GALNT2 gene within the ovary[J].PLoS Genetics,2013,9(9):e1003809.

[9]Drouilhet L,Taragnat C,Fontaine J,et al.Endocrine characterization of the reproductive axis in highly prolific Lacaune sheep homozygous for the FecLL mutation[J].Biol Reprod,2010,82(5):815～824.

[10]Lecerf F,Mulsant P,Elsen JM,et al.Localisation and mapping of a major gene controlling ovulation rate in Lacaune sheep[C].In:Procee dings of the 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production.Montpellier:INRA,Castanet-Tolosan,France.2002,（30）:753～756.

Detection on 803A＞G Mutation in 3′Untranslated Region of DLX3 Gene in Sheep and Goats

Guligena1,AIMAITI·Maiti1，YU Jian-guo1，YANG Hui-guo1,HAO Geng1,CHU Ming-xing2*,Maimaitiming3, PAN Zhang-yuan2,DI Ran2,LIU Qiu-yue2
(1.Institute of Animal Science,Xinjiang Academy of Animal Sciences,Urumqi 830000,China；2.Key Laboratory of Farm Animal Genetic Resources and Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture, Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China; 3.Nanshan Sheep Breeding Farm of Livestock Bureau of Xinjiang,Urumqi 830001,China)

Previous studies had shown that there was a strong linkage disequilibrium between DLX3 gene 3' noncoding region 803A>G mutation and FecL which was closely related with high fecundity of French Lacaune sheep.The 803A>G mutation of DLX3 gene was detected in seven sheep breeds (Small Tail Han, Hu,Wadi,Dorset,Texel,Dorper,Germany Mutton Merino sheep)and seven goat breeds(Jining Grey,Guizhou White,Jintang Black,Chengdu Ma,Liaoning Cashmere，Boer,Angora goats)using PCR-SSCP.The results indicated that the 803A>G mutation did not exist in the fourteen breeds tested.The 3′untranslated region of DLX3 gene was highly conserved among sheep and goats.The 803A>G mutation had no significant effect on prolificacy in the above fourteen breeds.

sheep；goat；prolificacy；DLX3 gene；PCR-SSCP

S818.9

：A

：1003－6377（2015）04－0015-05

新疆维吾尔自治区科技支疆项目(2013911056)、中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-IAS13）和国家肉羊产业技术体系专项(CARS-39)资助

古丽格娜(1970-)，女，副研究员，长期从事动物遗传育种与繁殖工作。E-mail:1289112072@qq.com

储明星（1968-），男，博士，研究员，博士生导师。从事动物遗传育种与繁殖工作。E-mail:mxchu@263.net

2015-04-16，

2015-05-03